内皮抑制素对慢性阻塞性肺疾病肺血管重塑的影响

王昌明 蒋 明 吕 倩 梁荣感 李运千 (桂林医学院附属医院呼吸内科，广西 桂林 5400)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由气道慢性炎症引起的气流受限性疾病，其发病率在全球呈明显上升趋势，尤其以中老年患者居多，对人类健康产生了严重的损害，已经受到各国的重视并制定了相应的诊治指南。COPD气流受限不完全可逆，随着其病程的进展，外周气道阻塞、肺实质破坏、肺血管的异常、长期慢性缺氧发生了缺氧性肺血管收缩，肺血管内皮功能失调和肺血管重塑等最终导致肺动脉高压(PAH)的发生。其中，肺血管重塑在COPD的进展过程中起重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)是近年来发现的一种具有高度特异性的细胞因子，具有促进血管内皮细胞分裂、诱发血管形成及增加血管通透性的功能〔1〕。VEGF贯穿于COPD发展的全过程中，与肺血管重塑密切相关，参与COPD并发肺动脉高压的形成。内皮抑制素(Endostar)是一种特异性内源性血管生成抑制剂，能直接作用于血管，有效地抑制新生血管的生成〔2，3〕。有研究表明，Endostar能阻止血管内皮细胞进入DNA合成期，抑制其合成、分泌VEGF〔4〕。本文通过观察各阶段COPD大鼠模型的VEGF的表达及其与肺血管重塑的关系，了解Endostar对其的干预效果，探讨Endostar对COPD肺血管重塑的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠64只，体重(180±20)g(购自桂林医学院SPF级动物实验中心)。

1.1.2 药物、试剂与仪器 脂多糖(美国Sigma公司)，香烟〔黄果树(特醇)，贵州中烟工业公司出品，焦油含量:13 mg〕，重组人血管内皮抑制素Endostar，中国天津麦得津公司，批号:20080104，电脑小动物呼吸机TKR-400H(南昌新长征医疗科技发展有限公司)，BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，VEGF免疫组化抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，免疫组化超敏S-P试剂盒KIT-9710(迈新生物技术开发公司)，RNA保存液(RNA LOCKER北京盛科博源生物科技有限公司)，VEGF及β-actin引物(上海生工生物工程有限公司合成)，RNAiso PLUS，、RT-PCR 试剂盒(TAKARA 大连宝生物生物工程有限公司)，大鼠VEGF ELISA检测试剂盒(美国ADL公司)，OLYMPUS荧光倒置显微镜(日本)，Image-pro-plus6.0图像分析软件。

1.2 实验方法

1.2.1 COPD模型的建立和动物分组 参照张建全等〔5〕方法建立动物模型。SPF级雄性SD大鼠64只，随机分为8组，每组8只，分别纳入实验组及Endostar干预组。正常对照组(A):于第1，14天气道内注入生理盐水0.2 ml，4 w后检测。慢支组(B):于第 1，14 天气道内注入脂多糖(LPS，0.2 ml)200 μg/次，4 w后检测。COPD组(C):第1，14天气道内注入LPS 200 μg/次，大鼠放入自制有机玻璃箱内(0.22 m3)内予香烟烟雾暴露，1 h/d，共4 w。COPD并低氧组:第1，14天气道内注入 LPS 200 μg/次，香烟烟雾暴露，1 h/d，共6 w。第5周起香烟烟雾暴露同时叠加18%低氧，每天8 h。Endostar干预组均自第3周起给予腹腔内注射 Endostar 7.5 mg·m－2·d－1(1.25 mg/kg)。空白对照组(A1)则从第3周起腹腔注射同Endostar剂量相同的生理盐水。

1.2.2 气道阻力及肺血流动力学测定及标本采集 用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，气管插管，接电脑小动物呼吸机TKR-400H，工作压力统一调定为6 kPa，检测气道阻力。暴露胸腔，把连接有压力换能器的导管插入肺动脉，通过压力传感器连接BL-420F生物机能实验系统检测平均肺动脉压(mPAP)。采动脉血予1 500 r/min离心，取上清保存于－80℃冰箱待VEGF因子检测。取右肺下叶组织浸入4%多聚甲醛溶液中固定，行VG+维多利亚蓝特殊染色观察肺血管重塑情况，行免疫组化染色观察VEGF表达情况。其余右肺组织放入RNA保存液(RNA LOCKER)中，于－80℃冰箱中备用，准备RNA提取。

1.2.3 HE染色及维多利亚蓝+VG特殊染色观察肺组织病理改变和肺血管重塑指标 大鼠右肺中叶组织HE染色观测COPD大鼠模型各阶段肺组织的病理改变、维多利亚蓝+VG特殊染色观察肺血管重塑指标。采用OLYMPUS荧光倒置显微镜及Image-pro-plus6.0图像分析软件进行数据分析。观察肺血管重塑指标:400倍高倍镜下对50 μm﹤直径﹤100 μm的肌化性动脉进行图像分析，计算血管壁厚度与血管外径比(WT%)、血管壁面积与血管总面积比(WA%)。

1.2.4 RT-PCR检测肺组织VEGF mRNA的表达 提取右肺组织总RNA，逆转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，以此为模板行PCR。扩增引物:①VEGF的上游引物:5'-GGCCTCTGAAACCATGAACT-3'，下游引物:5'-ATGCTGCAGGAAGCTCATCT-3'，扩增片段大小为385 bp。②β-actin的上游引物:5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物:5'-ACTCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'，扩增片段大小为220 bp。反应条件:95℃预变性 5 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，反应35个循环，72℃延伸7 min，产物在2.5%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶数字成像系统扫描分析扩增产物条带，测定各扩增条带吸光(A)值，以VEGF与β-actin的比值作为VEGF mRNA相对含量。

1.2.5 血清VEGF水平的测定 应用大鼠VEGF的ELISA检测试剂盒检测血清中的VEGF水平。操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.6 免疫组化S-P法检测肺组织VEGF的表达水平 免疫组化步骤按S-P法试剂盒进行。VEGF一抗血清稀释度为1∶100。用PBS替代相应一抗作阴性对照。VEGF阳性染色为棕黄色或棕褐色颗粒，主要定位在胞浆。免疫组化切片放大400倍，以Image-pro-plus6.0软件分析数据，选取直径为50～100 μm肺动脉，分析各组肺血管免疫组化阳性细胞光密度值并进行比较。

1.3 统计学处理 实验数据采用SPSS13.0软件进行统计，计量资料数据用±s表示，对各组数据先进性正态检验和方差齐性分析，遵循正态分布、方差齐者组间两两比较采用S-N-K法分析，方差不齐者采用Games-Howell法。同一实验组与药物干预组间采用配对检验。将实验大鼠血清VEGF浓度、肺组织VEGF mRNA表达及肺组织免疫组化的VEGF表达量分别与肺血管重塑指标WT%、WA%进行Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 气道阻力变化 相同工作压力下(6 Kpa)，大鼠气道阻力指标A、B组无明显变化(P＞0.05)，C、D组气道阻力较A组增加，且B、C、D组气道阻力依次递增，差异有统计学意义(P＜0.05)。各药物干预组与各自对应的试验组比较C1组较C组、D1组较D组气道阻力降低(P＜0.05)。见表1。

2.2 肺血流动力学 平均肺动脉压(mPAP)指标，与A组相比，B组与A组无明显差异(P＞0.05)，而C、D组mPAP较A组明显增高(P＜0.01)。各药物干预组与各自对应的试验组比较，可见C1组较C组，D1组较D组mPAP降低(P＜0.05)。见表1。

2.3 肺组织病理改变及肺血管重塑指标 大鼠肺组织HE染色显示，A组气道结构正常，管壁完整，无炎症细胞浸润。B组气道壁结构基本完整，有少量炎症细胞浸润。C组可见气道上皮黏液杯状细胞增生，部分肺大泡形成，气道管壁可见炎症细胞浸润。D组气道黏膜充血水肿，黏液杯状细胞及气道平滑肌增生明显，小血管肌化明显。气道管壁炎症细胞浸润加重。说明B、C、D组病理表现符合慢支、COPD、COPD并低氧的病理改变。A1组、B1组与对应的A、B组相比，差异不明显。C1组与C组相比炎症细胞浸润减少，肺大泡情况有改善。D1组比D组炎症细胞浸润减少，气道平滑肌断裂、小血管肌化等有所改善。

维多利亚蓝+VG特殊染色分析血管重塑指标，与A组相比，B组肺血管重塑指标WT%、WA%无明显变化(P＞0.05)，C、D组WT%、WA%比A组明显增高(P＜0.05)。与D组相比，B、C两组WT%比 D组降低，B组WA%比D组降低(P＜0.05)。C1组较C组，D1组较D组的WT%、WA%降低(P＜0.05)。而A1、B1组WT%、WA%与对应的试验组A、B组比较无明显差异(P＞0.05)。见表2。

2.4 肺组织内VEGF mRNA的表达 与A组相比，B、C、D三组VEGF mRNA表达增强(P＜0.05)。D组VEGF mRNA表达强于B组(P＜0.05)。各药物干预组与各自对应的试验组比较，VEGF mRNA表达 A组与 A1组相比无明显差异(P＞0.05)，B1组较B组，C1组较 C组，D1组较 D组肺组织内VEGF mRNA表达降低(P＜0.05)。说明 B、C、D组 VEGF mRNA表达逐渐增强，药物抑制后，此三组的VEGF mRNA表达减弱。见表3，图1。

表1 各组气道阻力及平均肺动脉压的比较 ± s，n=8)

表1 各组气道阻力及平均肺动脉压的比较 ± s，n=8)

与A组比较:1)P＜0.05;与D组比较:2)P＜0.05;与各自对应实验组比较:3)P＜0.05，下表同

组别 气道阻力(kPa)mPAP A组0.37±0.05 22.07±1.85 B组 0.39±0.042) 24.51±2.602)C组 0.51±0.041)2) 29.65±3.631)D组 0.61±0.071) 34.61±5.801)A1组 0.37±0.05 22.55±2.10 B1组 0.35±0.03 23.73±4.53 C1组 0.46±0.043) 23.99±3.823)D1组 0.51±0.083) 24.68±4.043)

表2 肺血管重塑指标分析(± s，n=8)

表2 肺血管重塑指标分析(± s，n=8)

组别WT% WA%A组13.36±1.33 44.90±4.21 B组 15.37±2.072) 49.70±5.101)C组 17.21±2.361)2) 56.92±6.631)D组 20.62±1.581) 61.57±5.891)A1组 12.66±1.80 44.25±3.75 B1组 13.13±1.43 47.84±2.12 C1组 14.06±2.283) 49.14±2.453)D1组 16.18±1.563) 52.76±4.463)

2.5 血清中VEGF的测定 分析不同组血清中VEGF浓度的变化，可见血清中血清中D组浓度明显高于A组，差异有统计学意义(P＜0.05);各药物干预组与各自对应的试验组比较，可见B1组较B组，C1组较C组，D1组较D组血清中VEGF浓度降低(P＜0.05)。见表3。

2.6 肺血管VEGF免疫组化结果 免疫组化显示VEGF阳性表达在气道上皮及肺血管内皮细胞胞浆，呈棕黄色。与A组比较，C、D组 VEGF表达增高(P＜0.05)，而 A、B组间以及 C、D组之间表达无差异。各药物干预组与各自对应的试验组比较，肺血管免疫组化VEGF表达A组与A1，B组与B1组相比无明显差异(P＞0.05)，C1组较C组，D1组较D组肺血管内皮的VEGF表达下降(P＜0.05)。提示COPD组及COPD并低氧组的VEGF表达显著高于正常组，药物干预后此两组VEGF表达下调。见表3，图2。

2.7 肺组织VEGF表达与肺血管重塑的相关性分析 将实验大鼠血清VEGF浓度、肺组织VEGF mRNA表达及肺组织免疫组化的VEGF表达量分别与肺血管重塑指标WT%、WA%进行Pearson相关性分析，发现血清 VEGF浓度和肺小动脉的WT%、WA%呈正相关(血清VEGF浓度与WT%的相关系数r=0.780，血清 VEGF浓度与 WA%的相关系数 r=0.711，均P＜0.05);肺组织VEGF mRNA表达和肺小动脉的WT%、WA%呈正相关(VEGF mRNA表达与WT%的相关系数r=0.833，VEGF mRNA表达与WA%的相关系数r=0.729，均P＜0.05);VEGF表达量和肺小动脉的 WT%、WA%呈正相关(VEGF表达量与WT%的相关系数r=0.975，VEGF表达量与WA%的相关系数r=0.982，均P＜0.05)。

图1 各组VEGF mRNA表达情况

表3 各组VEGF mRNA的表达情况、血清中VEGF浓度(ng/ml)及免疫组化VEGF在各组肺血管表达光密度值比较

图2 肺组织VEGF表达情况(免疫组化染色，×400)

3 讨论

多种因素如吸烟、低氧、炎性因子等均可刺激VEGF的分泌〔6〕。肺血管重塑在COPD并发的肺动脉高压的形成、发展和维持中起重要作用。VEGF可通过激活血管平滑肌细胞内的活性氧(ROS)信号及 NF-κB转录致使血管平滑肌迁移，说明VEGF表达增加与肺动脉重塑有关〔7〕。Santos等〔8〕发现 COPD患者肺动VEGF的表达与疾病的严重程度相关，在无明显缺氧的COPD早期VEGF表达增加，可能是内皮功能紊乱、血管重建中的一个重要的因子。Kranenburg等〔9〕发现COPD患者细支气管、肺泡上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及气道平滑肌细胞VEGF及其受体表达明显增加，同时说明VEGF及其受体不仅与COPD的血管重塑有关，也与COPD气道重建、气流受限的形成有关。Endostar能特异地作用于内皮细胞，尤其是微血管的内皮细胞，控制新生血管内皮细胞的增殖，诱导其凋亡，抑制其迁移，从而抑制血管生成和肿瘤生长〔10〕。目前在临床已用于多种肿瘤的治疗，具有较好的疗效和安全性〔2，3〕。Kim〔11〕等报道内皮抑素通过结合 VEGF 受体KDR/Flk-1细胞膜外的结构域，阻断VEGF诱导的KDR/Flt-1受体型酪氨酸激酶活化和下游事件，后者包括激活ERK、MAPK和FAK，从而抑制内皮细胞增殖和迁徙作用。伍尚敏〔4〕等研究发现，Endostar作用前血管内皮细胞VEGF cDNA表达量明显高于Endostar作用后的表达量，Endostar能阻止血管内皮细胞进入DNA合成期，抑制其合成、分泌VEGF〔4〕。

本结果COPD疾病过程中，随着病程进展，VEGF表达逐渐上调，与疾病严重程度相关，给予Endostar干预后，疾病严重程度相关指标下降，提示Endostar可能通过拮抗内源性VEGF的产生来抑制微血管重塑，达到减缓COPD病程进展的目的。

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