原花青素对STZ致胰岛细胞损伤的保护作用

赵 丽 陈红梅 蔺美玲 刘世雄 李中平 王志强 张小郁 郑天珍

(兰州大学基础医学院生理学与心理学研究所，甘肃 兰州 730000)

原花青素(Proanthocyanidins，PC)，是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮的总称。按聚合度大小，二至四聚体称为低聚原花青素(oligoneric proanthocyanidins)，五聚体以上称为高聚原花青素(procyanidolic polymers)。1961年德国的Karl等从山楂新鲜果实的提取物中首次分离所得，以后人们又相继在葡萄、山楂、花生、银杏等植物中发现了原花青素的存在〔1〕。由于药理研究已经证实PC具有很强的抗氧化活性，且Faria〔2〕和Silva等〔3〕研究都显示原花青素从单体到五聚体随着聚合度的增加，抗氧化活性也随之增加，使得人们对PC的开发和利用极为重视。国内外多项研究已证实PC除具有优越的抗氧化活性还具有酶抑制活性、血管保护活性、抗炎、抗辐射及抗肿瘤多种活性等，已在药品、保健品和化妆品中得到广泛应用〔4，5〕，是一种极具发展前景的天然植物提取物。Qa'Dan等〔6〕研究表明，原花青素可以降低血脂，抑制胰岛β细胞凋亡，促进胰岛素分泌。涂献玉等〔7〕研究显示PC能够降低糖尿病小鼠的血脂含量，提高胰岛分泌功能，有利于改善糖尿病症状和减少糖尿病心血管并发症的发生，但有关PC对胰岛细胞保护作用的研究报道甚少。本研究利用大鼠胰岛素瘤细胞作为研究对象，旨在细胞水平上初步探讨原花青素对链脲佐菌素损伤的胰岛细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)购自中国典型培养物保藏中心;原花青素(纯度＞98%)购于天津市尖峰天然产物研究开发有限公司;RPMI 1640培养基、胰蛋白酶美国Gibco公司产品;新生牛血清，杭州四季青生物工程有限公司产品;链脲佐菌素(STZ)、十二烷基硫酸钠(SDS)、噻唑蓝(MTT)，美国Sigma公司产品;胰岛素放射免疫检测试剂盒购自山东三维诊断技术有限公司;丙二醛(MDA)试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 细胞培养 INS-1细胞，用RPMI1640培养液培养，培养液内含10%新生牛血清，1 mmol/L丙酮酸钠，2 mmol/L L-谷氨酰胺，50 μmoL/L β-巯基乙醇，5.6 mmol/L 葡萄糖，1 ×105IU/L青霉素和100 mg/L链霉素。细胞置于37℃，5%CO2及饱和湿度的恒温箱中培养，每2～3 d传代1次。取对数生长期的细胞进行试验。

1.3 MTT比色法测定细胞存活率 将培养至对数生长期的INS-1细胞用0.25%的胰酶消化制成单细胞悬液，以1×105的细胞密度接种于96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液100 μl，随机分为为正常对照组、STZ(3 mmol/L)组、PC保护组(1～5组)，每组设6个复孔，并设置空白调零组。培养24 h后，STZ组、PC保护组分别加入STZ溶液，使其终浓度为3 mmol/L，PC保护组(1～5组)同时加入不同浓度的PC溶液，使其终浓度分别为 6.25、12.5、25、50、100 μg/ml，细胞继续培养 12 h，然后各孔分别加入终浓度为5 mg/ml的MTT溶液，细胞继续培养4 h后，各孔分别加入10%SDS溶液，置于细胞培养箱中放置过夜后，用酶标仪测定OD值，检测波长为570nm。细胞的存活率是以对照组的细胞存活率为100%，各实验组的细胞的存活率%=(各实验组的OD值/对照组的OD值)×100%。

1.4 放免法检测胰岛素分泌量 将培养至对数生长期的INS-1细胞用0.25%的胰酶消化制成单细胞悬液，以1×105的细胞密度接种于96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液200 μl，随机分为为正常对照组、STZ(3 mmol/L)组、PC保护组(1～5组)，每组6个复孔。细胞培养箱中培养24 h后，STZ组、PC保护组分别加入STZ溶液，使其终浓度为3 mmol/L，PC保护组(1～5组)同时加入不同浓度的PC溶液，使其终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 μg/ml，细胞继续培养 12 h 后，取细胞上清液，用放免法测其胰岛素的释放量。

1.5 比色法检测MDA含量和T-AOC活性 将INS-1细胞按1.4的方法分组培养后，取细胞上清液，根据试剂盒的要求进行操作，用比色法测定吸光度，按试剂盒的要求计算MDA含量和T-AOC活性。

1.6 统计学分析 所有数据均采用SPSS16.0软件进行统计分析，各项指标均以±s表示，各组之间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 PC对STZ损伤INS-1细胞存活率的影响 处理培养后的正常对照组、STZ(3 mmol/L)组、PC保护组(1～5组)的INS-1细胞的存活率用MTT法测定，测定各组的OD值，并计算细胞存活率，见表1。

STZ组中的细胞从镜下观察明显出现了细胞体积的缩小，细胞间隙增大，形态变圆，从表1中发现，STZ组细胞存活率明显低于正常对照组与STZ组相比，不同浓度的PC各组的细胞存活率均有增高，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01);并且PC浓度达到25 μg/ml时，PC保护组明显呈现出剂量-效应关系。

2.2 PC对STZ损伤INS-1细胞胰岛素释放量的影响 通过放免法检测了PC对STZ损伤INS-1细胞胰岛素释放量的影响，从表1中发现，STZ组的胰岛素释放量明显低于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01);在PC保护组(1～5组)中，对应的胰岛素释放量均高于STZ组，但是只有当PC的浓度达到12.5 μg/ml时，差异具有统计学意义(P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.3 PC对STZ损伤INS-1细胞的MDA含量，T-AOC活性的改变 PC对STZ损伤INS-1细胞的MDA含量，T-AOC活性的改变见表2。由表2可知，STZ组的细胞在加入STZ后，损伤程度与正常对照组比较，MDA含量的改变差异具有统计学意义(P＜0.01)，在PC(1～5)组中，当PC组的浓度高于12.5 μg/ml时，MDA含量的改变与STZ组相比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)，但各浓度组之间并没有出现出剂量-效应关系。而STZ组的细胞在加入STZ后，T-AOC活性的改变与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05);在PC(1～5)组中，当PC 的浓度为25、50、100 μg/ml时，T-AOC 活性的改变与 STZ 组相比较，差异具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。但这3个浓度组之间差异无统计学意义。

表1 原花青素对INS-1细胞增殖和胰岛素释放量的影响(±s)

表1 原花青素对INS-1细胞增殖和胰岛素释放量的影响(±s)

与正常对照组比较:1)P＜0.05，P＜0.01;与 STZ组比较:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

组别 剂量(μg/ml) OD值 存活率(%)胰岛素释放量(μIU/ml)正常对照组0 0.547±0.017 100 8.376 7±2.113 4 STZ组 0 0.362±0.016 66.3±0.0592)5.063 3±0.814 52)PC-1组 6.25 0.411±0.028 75.4±0.0763) 6.006 7±1.166 34 PC-2组 12.5 0.429±0.055 79.0±0.1324)6.741 7±0.976 53)PC-3组 25 0.511±0.006 93.7±0.0584)6.858 3±1.179 013 PC-4组 50 0.587±0.033 107.4±0.0584) 7.533 3±1.7044)PC-5组 100 0.647±0.078 119.1±0.1944)8.031 7±1.126 264))

表2 原花青素对STZ损伤INS-1细胞保护作用的影响±s)

表2 原花青素对STZ损伤INS-1细胞保护作用的影响±s)

组别 剂量(μg/ml) MDA释放量T-AOC正常对照组0 2.013 7±0.756 4 9.533 3±1.026 3 STZ组 0 6.314 0±3.541 62)3.955 6±3.107 21)PC-1组 6.25 4.607 5±1.981 2 5.316 7±2.340 2 PC-2组 12.5 3.071 7±1.083 43) 5.583 3±2.680 7 PC-3组 25 2.901 0±0.904 53)9.216 7±4.317 93)PC-4组 50 2.719 0±1.076 43)10.916 7±2.399 74)PC-5组 100 2.207 1±1.320 43)12.800 0±3.890 74)

3 讨论

糖尿病是由于胰岛素绝对或相对不足以及胰岛素抵抗导致的以糖代谢紊乱为主的全身性代谢疾病。胰岛素抵抗与胰岛β细胞功能缺陷是糖尿病发生的主要机制。目前普遍认为，胰岛β细胞功能障碍是2型糖尿病发生的必要条件，而胰岛β细胞凋亡是造成INS分泌能力绝对下降的重要因素，在2型糖尿病的发病中扮演了重要的角色〔8，9〕。

正常生理状态时，机体内活性氧簇(ROS)的产生与消除处于一个动态平衡状态。Brownlee〔10〕提出的统一机制学说认为，高糖环境下，细胞内过多生成的氧自由基可以激活多元醇、晚期糖基化终末产物、蛋白激酶C等途径，而后者反之又促进自由基的生成，从而形成恶性循环，加速ROS的形成。糖尿病患者一方面由于ROS的产生明显增多，另一方面由于胰岛β细胞内的抗氧化系统处于较低的水平，易于发生氧化应激反应，造成胰岛β细胞的凋亡及功能下降，导致胰岛素合成分泌减少〔11，12〕而氧自由基又可以损伤胰岛细胞的细胞核和线粒体，导致胰岛素mRNA表达水平的下降，从而导致胰岛素的分泌下降;并且由于自由基的增多造成脂质过氧化物损伤细胞膜，使得胰岛素受体被破坏和减少，也导致胰岛素分泌水平的降低〔13〕。体内过剩自由基和活性氧的产生及引发的脂质过氧化反应，都可以诱发胰岛细胞的损伤、引发胰岛β细胞的凋亡，从而引发糖尿病。

由于氧化应激和糖尿病之间的关系，抗氧化治疗成为重要的手段。目前临床上使用的抗氧化剂主要为维生素E，维生素C及α-硫辛酸〔14〕，但是疗效并不如预期的那么好。PC是迄今为止发现的有效的自由基清除剂之一，Bagchi〔15～17〕等人研究证实PC具有高度生物学活性，体内体外均能够有效清除自由基，减少自由基诱导的脂质过氧化及损伤，其对组织细胞的保护作用明显高于维生素E和维生素C。国内外的研究已证明原花青素具有促胰岛素分泌的功能〔6〕。动物实验也已证明PC可以显著升高2型糖尿病大鼠血清SOD、降低MDA，能够降低2型糖尿病大鼠的氧化应激水平，对2型糖尿病有一定的预防和治疗作用〔18，19〕。

本研究结果显示，不同浓度的PC作用于STZ损伤的胰岛β细胞后，胰岛β细胞的存活率显著提高，并呈现出一定的量效关系，从胰岛素的检测中发现，单纯的STZ作用组，胰岛素的分泌量明显降低，而PC保护组，浓度在12.5 100 μg/ml之间的INS-1细胞胰岛素分泌量明显提高，说明PC能够有效的维护胰岛β细胞的存活率和功能。

MDA是脂质过氧化物产物，可作为评价脂质过氧化反应强弱的指标，降低MDA的含量则能起到保护细胞的作用;同时体内存在抗氧化系统，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导氧化应激的产生。本实验结果显示，STZ组MDA的生成明显提高，而T-AOC的含量则降低。与STZ组比较，当PC保护组浓度高于12.5 μg/ml时MDA含量明显降低，而当浓度高于25 μg/ml时T-AOC活性明显升高，说明PC对STZ致INS-1细胞损伤有明显的保护作用，能够抑制MDA的生成，保护INS-1细胞，同时也可以提高INS-1细胞的总抗氧化能力，使细胞清除自由基的能力增强，减少了MDA的含量，降低了STZ对INS-1细胞的损伤程度，最终促进了INS-1细胞胰岛素分泌量的增加。

综上所述，PC能够对STZ损伤的INS-1细胞起到有效的保护作用，可以促进STZ损伤的INS-1细胞分泌胰岛素，这可能与PC提高STZ损伤的INS-1细胞的总抗氧化能力，增强细胞清除自由基的能力，提高细胞存活率，增强细胞活性的作用有关。PC保护STZ损伤的INS-1细胞及促进细胞分泌胰岛素的作用机制仍在进一步的探讨中。

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