Th1/Th2细胞因子失衡对干扰素α诱发老年女性甲状腺功能低下的相关性分析

李素清 刘 平 高 杨 刘金霞 马小彬 (承德医学院附属医院，河北 承德 067000)

干扰素-α(IFN-α)联合病毒唑是目前常用的也是较为有效的治疗慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)的方法。然而，其骨髓抑制、抑郁、甲状腺功能异常等严重不良反应，常影响患者的依从性和治疗效果，尤其在老年女性患者，甲状腺功能减退发生率明显高于男性和青年患者〔1〕，甚至发生老年抑郁。本研究通过检测CHC患者应用IFN-α过程中血清甲状腺激素水平和外周血单核细胞内Th1细胞因子〔IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF-α)〕及 Th2 细胞因子〔白细胞介素-4(IL-4)、IL-10〕mRNA的表达水平，以探讨TFN-α对Th1/Th2细胞因子表达的影响并分析这一影响与甲状腺功能低下的关系，为CHC患者顺利完成抗病毒治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 54例CHC患者(CHC组)，于2006～2008年在我科门诊或住院病房行IFN治疗，其中男30例，女24例;年龄18～65〔平均(35.6±17.9)〕岁。既往无精神疾病及其他身心疾病等遗传疾病史。治疗前进行血、尿常规、肝功能、丙肝病毒(HCV)抗体、HCV、甲状腺功能、肾功能、血糖、自身免疫相关项目等详细检查，严格按照中华人民共和国卫生行业标准《丙型病毒性肝炎诊断标准及处理原则》选择研究对象，排除其他类型肝炎病毒和免疫缺陷病毒(HIV)病毒感染〔1〕。另外选择同期体检的正常人血清20人份，作为正常对照组。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 应用聚乙二醇干扰素(PEG-IFNα-2a)180 μg，每周一次，皮下注射，治疗过程中严密监测患者用药后不良反应，出现自身免疫、骨髓抑制等严重不良反应者需被迫停药者，排除在统计分析范围内。所有病例在应用IFN外均应用相似的保肝降酶治疗药物，在治疗观察期间没有服用其它对甲状腺水平有影响药物，饮食等。用药时间48 w。

1.2.2 甲状腺素水平的检测 分别在治疗前、治疗12 w和治疗终点(疗程结束时)，空腹抽取患者静脉血10 ml，分离血清和外周血单核细胞，化学发光法检测血清三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine，T3)、游离三碘甲状腺氨酸(free triiodothyronine，FT3)、甲状腺素(thyroxin，T4)、游离甲状腺素(free thyroxin，T4)、促甲状腺素(thyroid stimulating hormone，TSH)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin，TG)试剂盒由美国雅培公司提供，并按说明书要求进行操作。

1.2.3 Th1/Th2细胞因子检测 分离外周血单核细胞，细胞总RNA抽提药盒TRIzol(GIBCO公司)抽提细胞总RNA。按SuperscriptⅡ药盒(GIBCO公司)说明书，将mRNA逆转录为cDNA。β-肌动蛋白(β-actin)、IFN-γ、TNF-α、IL-10 引物由上海生工合成，引物序列见表1。用所得cDNA进行RT-PCR反应，扩增内参照 β-actin 及 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10，PCR 反应条件和引物序列见表1〔2〕。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶(含终浓度0.5 μg/ml溴乙锭)上电泳，Gel-PRO ANALYZER凝胶定量分析软件进行灰度分析，得到β-actin及4种细胞因子灰度值，将4种细胞因子灰度值分别除以β-actin灰度值，从而得到4种细胞因子相对含量(%)。

1.3 统计学方法 应用SAS8.0统计软件进行分析，数据资料以±s表示，采用t检验和方差分析。

2 结果

2.1 PEG-IFN-α2a治疗前后甲状腺激素水平 应用PEG-IFN-α2a治疗前和治疗12 w时，检测血清中甲状腺激素水平，TSH升高，T3、T4、FT3和FT4降低，其甲状腺素水平显著低于正常水平(P＜0.05);与正常对照组比较，治疗前无统计学差异(P＞0.05)。见表2。

2.2 CHC患者治疗前与正常对照组Th1/Th2各细胞因子表达水平的比较 CHC患者与正常对照组比较，Th1细胞因子表达水平较低，有统计学差异(P＜0.05);而Th2细胞因子表达水平偏高，无统计学差异(P＞0.05);感染HCV后出现Th2细胞因子分泌倾向，形成CHC而不能够自愈。见表3。

表1 Th1/Th2型细胞因子PCR引物序列扩增片段大小及扩增条件

表2 PEG-IFN-α2a治疗前、后甲状腺激素水平比较(s)

表2 PEG-IFN-α2a治疗前、后甲状腺激素水平比较(s)

与治疗后比较:1)P＜0.05

组别 n TSH(mIU/L) T3(ng/ml) T4(ng/ml) FT3(pmol/L) FT4(pmol/L)正常对照组 20 3.15±0.87 3.79±0.29 115.27±21.41 6.52±1.69 18.42±4.10 CHC组治疗前 54 3.48±3.681) 3.32±1.591) 116.58±37.981) 5.18±1.791) 16.97±3.381)CHC组治疗后 54 9.28±3.83 2.24±1.66 104.13±37.25 3.87±1.13 13.76±3.64

2.3 CHC患者治疗前后各组Th1/Th2细胞因子表达水平的变化 IFN-α联合病毒唑治疗12 w时Th1/Th2细胞因子表达水平进行分析，发现治疗后Th1类细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达水平显著增高，Th2类细胞因子IL-4和IL-10的表达水平与治疗前相比无显著性变化。见表4。

表3 CHC患者治疗前与正常对照Th1/Th2细胞因子表达水平 ± s，%)

表3 CHC患者治疗前与正常对照Th1/Th2细胞因子表达水平 ± s，%)

组别 n IFN-γ TNF-αIL-4 IL-10正常对照组 20 27.29±5.26 24.13±3.55 10.07±3.33 15.97±3.21 CHC治疗组 54 24.34±3.12 20.32±3.48 12.69±3.22 17.62±2.52 t值 2.963 3.068 1.094 1.897 P值0.004 0.003 0.061 0.612

表4 CHC患者治疗前和治疗12 w时Th1/Th2细胞因子表达水平的变化(±s，%，n=54)

表4 CHC患者治疗前和治疗12 w时Th1/Th2细胞因子表达水平的变化(±s，%，n=54)

组别 IFN-γ TNF-αIL-4 IL-10治疗前 24.34±3.12 20.32±3.48 12.69±3.221)17.62±2.52治疗后 27.38±4.62 24.38±5.26 13.95±4.30 16.36±5.24 t值 4.007 4.730 1.723 1.292 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

3 讨论

Th1和Th2细胞因子诱导的免疫反应相互抑制、相互调节，处于动态平衡状态，维持正常的细胞免疫和体液免疫功能。Th1细胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子，参与细胞免疫反应;Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子，参与体液免疫反应。抗病毒治疗如能激起强的Th1和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，则病毒被清除，而弱的Th1反应常伴随着病毒的持续感染和治疗失败〔3〕。IFN-α，作为一种炎症因子，联合病毒唑治疗CHC的机制之一是由于IFN-α能够促进Th1细胞因子的分泌〔4〕。在本研究中，从基因表达水平检测CHC患者在应用INF治疗前后Th1/Th2细胞因子mRNA表达水平，并观察其与甲状腺激素水平的关系，探讨INF诱导患者甲状腺功能低下免疫学机制，结果发现，在抗病毒治疗前，CHC患者IFN-γ、TNF-α的表达均明显低于正常对照组。提示CHC患者的细胞免疫功能下降，对病毒清除能力减弱，这可能是造成HCV持续感染的原因之一。对IFN-α联合病毒唑治疗12 w时Th1类细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达水平显著增高。提示抗病毒治疗充分激活了Th1型免疫反应，患者的细胞免疫功能得到恢复，并因此获得了良好的治疗效果。进一步研究发现，INF治疗后患者甲状腺激素水平下降，可能也与由Th1型细胞因子产生增多，上调甲状腺滤泡细胞主要组织相容抗原大分子的表达，介导细胞免疫，促进甲状腺内淋巴细胞浸润，并使浸润的淋巴细胞和巨噬细胞激活并释放IFN-α、IL-1、IL-6等细胞因子及产生氧自由基，甲状腺本身出现自身免疫性炎症，分泌和合成甲状腺激素功能减退〔5〕。IL-4主要产生于Th2细胞，可促进IgG、IgA和IgE等抗体的产生，介导体液免疫，在INF治疗过程中无明显变化，因此，Th1和Th2平衡在自身免疫性甲状腺疾病中被打破，其分泌的细胞因子在表达的量上能够反映机体总的免疫倾向。

1 彭文伟.传染病学〔M〕.第5版.北京:人民卫生出版社，2001:15-45.

2 Canataroglu AA，Akkiz H.Serum profile of T helper 1 and T helper 2 cytokines in patients with chronic hepatitis C virus infection〔J〕.Turk J Gastroenterol，2003;14(1):7-11.

3 Wan L，Kung YJ，Lin YJ，et al.Th1 and Th2 cytokines are elevated in HCV-infected SVR(-)patients treated with interferon-alpha〔J〕.Biochem Biophys Res Communications，2009;379(4):855-60.

4 Fujimoto T，Tomimatsu M，Iga D，et al.Changes in the Th1/Th2 ratio during a 24-week course of an interferon alpha-2b plus ribavirin combination therapy for patients with chronic hepatitis C〔J〕.J Gastroenterol Hepatol，2008;23(8-2):432-7.

5 Miller AH，Norman Cousins Lecture.Mechanisms of cytokine-induced behavioral changes:psychoneuroimmunology at the translational interface〔J〕.Brain Behav Immun，2009;23(2):149-58.