Ezrin蛋白和CD44－V6蛋白在结肠腺癌中的表达及其意义

赵树鹏 齐凤杰 (辽宁医学院附属第一医院普通外科，辽宁 锦州 121001)

肿瘤的侵袭和转移是一个多因素参与的多步骤发展过程。研究表明，Ezrin和CD44－V6蛋白在肿瘤的浸润和转移过程中起着重要作用。但有些研究结果尚未达成共识。Moilanen等〔1〕报道Ezrin蛋白在卵巢浆液性囊腺癌中表达越低，其预后越差，而Akisawa等〔2〕报道在胰腺癌中Ezrin蛋白高表达则预示患者预后不良。Hiscox等〔3〕在体外结肠癌细胞株研究显示Ezrin蛋白的缺失与肿瘤细胞的运动能力和侵袭性增加有关。上述研究结果均说明Ezrin蛋白在肿瘤转移过程中存在着更复杂的作用机制，可能参与肿瘤转移的多个环节。本研究通过检测Ezrin和CD44－V6蛋白在结肠癌中的表达情况及其与临床病理参数之间的关系，探讨其在结肠癌侵袭及转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2006年1月至2009年1月辽宁医学院附属第一医院行结肠癌手术切除病例共100例，其中包括癌旁肠组织20例;结肠腺癌80例，高分化17例，中－低分化63例;未侵及全层15例，侵及全层65例;有淋巴结转移48例，无淋巴结转移32例。所有病例术前均未采取放疗、化疗及免疫治疗。

1.2 试剂 鼠抗人Ezrin单克隆抗体，鼠抗人CD44－V6单克隆抗体，浓缩型DAB显色液以及S－P染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法 将蜡块标本制成4 μm连续切片，经脱蜡、脱苯、水化后进行HE和免疫组化染色。以已知阳性组织为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。采用双评分法进行判定，随机选择5个高倍镜视野(400×)，按阳性细胞百分率(A值)评分:＜25%为1分，25～50%为2分，＞50%为3分;按染色强度(B值)评分:无显色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;染色阳性细胞数与染色强度的乘积得分作为判定标准:0～4分者为阴性;5分以上为阳性。

1.4 统计学处理 采用SPSS13．0统计软件。计数资料应用χ2检验、Fisher精确概率法;等级相关检验用 Spearman相关检验。

2 结果

2.1 Ezrin和CD44－V6蛋白在结肠癌及癌旁肠组织中的表达 Ezrin和 CD44－V6蛋白分别定位于胞质和胞膜。Ezrin及CD44－V6蛋白在癌旁肠组织中阳性表达率分别为35．0%、25．0%，肠腺癌组织中的阳性表达率分别为83．75%、82．5%，两种蛋白的阳性表达率分别高于癌旁组织差异显著(P＜0．01)。

2.2 Ezrin及CD44－V6蛋白在结肠腺癌中的表达与临床病理参数的关系 Ezrin及CD44－V6蛋白在结肠高分化腺癌组的阳性表达显著低于低－中分化腺癌组，在有浆膜层浸润组显著高于无浆膜层浸润组，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，各组间的表达差异具有统计学意义(P＜0．01)。在Dukes分期中，两种蛋白在Dukes C、D期的表达显著高于Dukes A、B期，差异有统计学意义(P＜0．01)。Ezrin及CD44－V6蛋白在结肠腺癌中的表达与性别、年龄、肿物最大直径无明显相关性(P＞0．05)。见表 1，图 1。

2.3 Ezrin及CD44－V6蛋白在结肠腺癌中表达的相关性分析 Ezrin及CD44－V6蛋白在80例结肠腺癌中同时阳性表达的例数为60例，占总数的75．00%(60/80)，而两者同时阴性表达的例数为7例，占总数的8．75%(7/80)，应用Spearman相关检验检测结肠腺癌中Ezrin及CD44－V6蛋白表达的相关性，两者表达呈正相关(r's=0．421，P=0．000)。进一步观察发现，在60例Ezrin及CD44－V6蛋白同时阳性表达的患者中，淋巴结转移率高达65．0%;7例两者同时阴性表达的患者，只有1例肠系膜淋巴结出现转移，转移率仅为14．29%，两者表达上的差异具有统计学意义(P＜0．01)。

表1 Ezrin及CD44-V6蛋白在结肠腺癌中的表达与临床病理参数的关系〔n(%)〕

图1 Ezrin及CD44-V6蛋白在结肠癌中的表达(SP法，×200)

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，恶性肿瘤发生转移的基础是肿瘤细胞之间的黏附力下降，因此肿瘤细胞表面黏附分子的去黏附作用在肿瘤侵袭和转移过程中起着非常重要的作用。Ezrin属于埃丝蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)蛋白家族，Ezrin蛋白通过调整黏附因子和信号转导等途径，参与细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，从而进一步影响肿瘤细胞侵袭及转移等生物学行为〔4〕。CD44分子是一种分布广泛的细胞表面黏附分子，是细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)相互识别和作用的分子基础，并且具备一系列的生理功能。某些CD44分子的异常表达可显著提高恶性肿瘤细胞的转移能力，与恶性肿瘤转移密切相关〔5〕。有研究发现，Ezrin与CD44及其变异体形成复合物，在肿瘤细胞中共同表达〔6〕。本研究结果提示结肠腺癌的发生及浸润转移潜能的获得可能与Ezrin与CD44蛋白的表达上调有关。Ezrin与CD44两种蛋白在结肠腺癌的发生发展中可能起着协同作用。CD44－V6蛋白通过与其细胞内羧基端与Ezrin蛋白连接，影响细胞骨架的构象，从而改变肿瘤细胞的运动能力。本研究亦为上述的观点进一步提供了实验佐证。但肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的过程，Ezrin蛋白在肿瘤转移过程中扮演不同的重要角色〔7〕。Khanna 等〔8〕和 Yu〔9〕等通过实验表明，Ezrin 在具有高转移特性的鼠横纹肌肉瘤及骨肉瘤细胞株中高度表达，抑制横纹肌肉瘤细胞及骨肉瘤细胞中Ezrin的表达能显著抑制肿瘤的肺转移，提示Ezrin蛋白是肿瘤转移的关键因素，并且Ezrin蛋白的表达与肿瘤的预后密切相关。但另有一些研究发现，卵巢浆液性囊腺癌中Ezrin的低表达提示预后差，因此，Ezrin蛋白在肿瘤转移过程中存在着更复杂的作用机制。

1 Moilanen J，Lassus H，Leminen A，et al．Ezrin immunoreactivity in relation to survival in serous ovarian carcinoma patients〔J〕．Gynecol Oncol，2003;90(2):273－81．

2 Akisawa N，Nishimori I，Iwamura T，et al．High levels of ezrin expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines with high metastatic potential〔J〕．Biochem Biophys Res Commun，1999;258(2):395－400．

3 Hiscox S，Jiang WG．Ezein regulates cell－cell and cell－matrix adhesion，a possible role with E－cadherin/beta－catenin〔J〕．J Cell Sci，1999;112(18):3081－90．

4 Mäkitie T，Carpén O，Vaheri A，et al．Ezrin as a prognostic indicator and its relationship to tumor characteristics in uveal malignant melanoma〔J〕．Invest Ophthalmol Vis Sci，2001;42(11):2442－9．

5 Slven M，Krupinski J，Gaffney J，et al．Hyaluronan－mediated angiogenesis in vascular disease:uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways〔J〕．Matrix Biol，2007;26(1):58－68．

6 Setälä L，Lipponen P，Tammi R，et al．Expression of CD44 and its varant isoform v3 has no prognostic value in gastric cancer〔J〕．Histopathology，2001;38(1):13－20．

7 McClatchey AI．Merlin and ERM proteins:unappreciated roles in cancer development〔J〕?Nat Rev Cancer，2003;3(11):877－83．

8 Khanna C，Wan X，Bose S，et al．The membrane－cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis〔J〕．Nat Med，2004;10(2):182－6．

9 Yu Y，Khan J，Khanna C，et al．Expression profiling identifies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental homeoprotein Six－1 as key metastatic regulators〔J〕．Nat Med，2004;10(2):175－81．