结石性胆囊炎患者PLA2活性、CCK-A受体mRNA表达水平及其与幽门螺杆菌感染的关系及作用机制

郝晓尊 王会生 郝玉杰 崔庆贵 (迁安市人民医院普外科，河北 迁安 064400)

结石性胆囊炎患者约占普通外科住院患者的十分之一〔1〕。针对结石性胆囊炎发生原因，采取相应的预防措施，是提高患者生活质量的关键，但结石性胆囊炎的病因及其发生机制比较复杂，尚未完全明确〔2〕。目前，幽门螺杆菌(Hp)感染与结石性胆囊炎的确切关系及作用机制仍有很大争议。本研究通过对比分析结石性胆囊炎患者Hp感染情况及相关参数的异同，来探讨Hp感染与结石性胆囊炎的关系及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 临床资料 选取2009年1月至2011年03月我院普外科收治确诊的结石性胆囊炎患者192例(结石性胆囊炎组)，其中慢性结石性胆囊炎以右上腹痛伴恶心、呕吐为临床症状就诊，部分患者有发热症状。同时选取同期确诊为非结石性胆囊炎患者103例(对照组)。所有患者经超声和CT明确诊断，行腹腔镜胆囊切除术。两组患者在性别、年龄、病程和类别方面差异不显著(P＞0.05)，具有可比性。见表1。

1.2 标本取材 全身麻醉下行腹腔镜胆囊切除术。术中取出胆囊，用5 ml无菌注射器穿刺抽取胆汁约5 ml，置于无菌试管中;切开胆囊，剪取大小约2.0 cm×2.0 cm胆囊黏膜和胆囊颈部胆囊壁组织1.0 cm×1.0 cm左右，用10 ml生理盐水漂洗3次，置于无菌试管中;置－70℃冰箱中保存待检。

1.3 Hp感染测定 ①13C呼气试验:患者术前均在空腹状态下进行，检测结果分别以阴性和阳性表示(检测读数＜5.00为阴性)。②胆汁和胆囊黏膜Hp DNA检测:采用北京中山生物技术有限公司合成和纯化的引物进行PCR-DNA扩增检测，引物序列为5'-GCCAATGGTAAATAAGTT-3'和5'-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3'。经2%琼脂糖凝胶溴乙啶染色，紫外灯下观察。

1.4 相关指标测定 ①磷脂酶A2(PLA2)活性测定:取胆汁1 ml及胆囊黏膜1 g各加4 ml稀释液，玻璃匀浆器匀浆至细胞完全破碎。60℃水浴30 min后冷却，置4℃冰箱备用。采用盐酸滴定法测定PLA2活性，以消耗的盐酸计算组织PLA2的活力。②胆囊壁胆囊收缩素(CCK)-A受体表达的检测:用异硫氰酸胍一步法提取胆囊壁组织总RNA，紫外灯下观察RNA的完整性并测其紫外吸收值，取A260/A280值1.7～2.0的样品行RT-PCR，检测CCK-A受体mRNA表达。用CCK-A受体与β-actin电泳条带密度比值计算CCK-A受体mRNA表达相对量。③胆囊黏膜上皮细胞胃黏膜化生的观察:采用AB/PAS黏液组织化学染色，根据黏膜上皮组织学形态和细胞分泌黏液特点，观察胆囊黏膜上皮细胞胃黏膜化生情况，计算胃上皮化生率。④胆囊排空功能测定:术前由同一超声诊断医师用彩超测定空腹胆囊体积，计算胆囊排空率。

1.5 参数记录和比较 利用自行设计的调查表记录患者性别、年龄、病程、临床症状和诊断。观察并记录13C呼气试验、胆汁和胆囊黏膜Hp DNA检测结果，比较结石性胆囊炎组和对照组Hp感染情况。根据Hp DNA检测结果分为Hp阳性组和Hp阴性组，比较两组患者PLA2活性、CCK-A受体mRNA表达相对量、胃上皮化生率和胆囊排空率。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件，数据以x±s表示，数值变量采用两随机样本t检验，分类变量采用χ2检验。

2 结果

2.1 结石性胆囊炎组与对照组Hp感染情况比较 结石性胆囊炎组患者13C呼气试验、胆囊黏膜和胆汁Hp DNA检测Hp阳性率显著高于对照组(P＜0.05);其中胆汁Hp DNA阳性者的胆囊黏膜Hp DNA结果均为阳性。见表1。

2.2 Hp阳性组和Hp阴性组相关参数比较 Hp阳性组患者胆汁及胆囊黏膜PLA2活性和胃上皮化生率显著高于Hp阴性组(P＜0.05);而胆囊壁CCK-A受体mRNA表达相对量和胆囊排空率明显低于Hp阴性组(P＜0.05)。两组性别、年龄、病程和分类方面差异不显著(P＞0.05)。见表2。

表1 结石性胆囊炎组与对照组Hp感染情况比较

表2 Hp阳性组和Hp阴性组相关参数比较(±s)

表2 Hp阳性组和Hp阴性组相关参数比较(±s)

组别 n 男/女 年龄(岁) 病程(年) 急性/慢性 胆汁PLA2活性(U/L)胆囊黏膜PLA2活性(U/L)胃上皮化生率(%)CCK-A受体mRNA相对量(%)胆囊排空率(%)Hp阳性组 73 31/42 49.81±12.10 4.77±2.24 35/38 423.18±134.76 195.20±61.03 57.53(42/73)2.3±1.1 51.73±22.19 Hp阴性组 119 53/66 49.36±11.77 4.66±2.08 67/52 279.67±86.51 157.39±54.68 17.65(21/98) 9.6±3.7 69.60±14.32 t/χ2 值 0.017 0.254 0.345 0.956 8.990 4.449 30.868 16.403 6.784 P值 0.895 7 0.799 4 0.730 2 0.328 3 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

胆囊结石的形成是多因素作用的结果，但确切病因和机制仍不清楚。Hp是一种革兰染色阴性微需氧杆菌，具有很强的尿素酶活性，是上消化道疾病感染的主要细菌，在我国人群有较高感染率。祁义军等〔3〕研究表明结石性胆囊炎患者的结石、胆汁和胆囊黏膜中存在Hp DNA，胆道系统感染Hp可能和胆囊结石形成有一定关系。郝晓尊等〔4〕研究显示结石性胆囊炎患者中，46%胆汁和23%胆囊黏膜Hp PCR是阳性。田旭阳等〔5〕报道，结石性胆囊炎患者Hp感染率为35.6%，非结石性胆囊炎患者Hp感染率为18.9%，前者明显高于后者。曹健等〔6〕研究发现结石性胆囊炎患者胆汁Hp DNA阳性率为81.2%，显著高于对照组。本研究结果与上述研究结果相似，提示Hp感染可能是结石性胆囊炎形成的重要因素之一;其原因可能为①Hp感染时细菌使胆汁中可溶性直接胆红素转变成难溶性间接胆红素，而后者易与钙结合沉淀成石，Hp感染还将刺激机体免疫应答产生一系列相关抗体，通过体液免疫应答产生的相关抗体促进结石的形成;②Hp可产生多种酶类及代谢产物，直接破坏胆囊黏膜上皮细胞;③Hp与宿主相互作用，诱发局部免疫反应，诱导胆囊黏膜上皮细胞增殖和凋亡，同时破坏损伤因子和防御因子之间的平衡;④结石对胆囊黏膜直接损伤和造成胆道梗阻加剧结石性胆囊炎发生。

Hp在结石性胆囊炎发生中的作用机制涉及多种因子。祁义军等〔7〕研究显示Hp阳性结石性胆囊炎患者胆汁PLA2活性显著高于Hp阴性患者，而两组胆囊黏膜PLA2活性无明显差异。张万星等〔8〕报道称Hp阳性结石性胆囊炎患者胆囊排空率和胆囊壁CCK-A受体mRNA相对表达量明显低于Hp阴性患者。郝晓尊等〔9〕研究发现Hp感染结石性胆囊炎患者胆囊黏膜胃上皮或假幽门腺化生率显著高于无HP感染患者。本研究结果与上述研究结果相似，说明Hp在结石性胆囊炎发生中的作用机制可能与胆汁及胆囊黏膜PLA2活性、胆囊黏膜胃上皮化生、胆囊壁CCK-A受体mRNA表达和胆囊排空功能有关。其原因可能为Hp分泌的PLA为前列腺素等生物活性物质合成限速酶，前列腺素E2能够促进胆囊炎症反应并能促进胆囊黏膜分泌糖蛋白，糖蛋白参与胆石形成的起始阶段，是重要的促成核蛋白质，有利于胆结石形成。Hp感染使胆囊壁CCK-A受体表达降低，敏感性降低，致使胆囊排空功能异常，胆汁淤积，最终导致胆囊结石形成;而胆囊黏膜胃上皮化生有利于HP定植，促进Hp在结石性胆囊炎发生中发挥作用。

综上，Hp感染可能是结石性胆囊炎发生的重要因素之一，其作用机制可能与胆汁及胆囊黏膜PLA2活性、胆囊黏膜胃上皮化生、胆囊壁CCK-A受体mRNA表达和胆囊排空功能有关。但作用机制及与其他胆囊疾病的关系有待深入研究。

1 李 杰.老年结石性急性胆囊炎手术治疗探讨〔J〕.中国现代药物应用，2010;4(17):12.

2 Bystrovskaia EV，II'chenko AA.Pathogenetic and diagnostic aspects of postcholecystectomy syndrome〔J〕.Eksp Klin Gastroenterol，2009;(3):69-80.

3 祁义军，孟翔凌，徐阿曼，等.胆囊结石与胆囊黏膜及胆汁幽门螺杆菌、磷脂酶A-2的关系〔J〕.中华实验外科杂志，2005;11(8):1299-300.

4 郝晓尊，王会生，郝玉杰，等.结石性胆囊炎患者胆囊黏膜、胆汁和结石中幽门螺杆菌的检测研究〔J〕.现代中西医结合杂志，2009;18(9):968-9.

5 田旭阳，高艳君，杨 莉，等.幽门螺杆菌感染与胆囊结石形成关系的研究〔J〕.当代医学，2009;15(34):40-1.

6 曹 健，刘 莉.胆结石患者胆管幽门螺杆菌感染情况分析〔J〕.山东医药，2009;49(38):53.

7 祁义军，孟翔凌.幽门螺杆菌与胆囊结石形成关系的研究近况〔J〕.消化外科，2004;5(3):218-21.

8 张万星，郭怀斌，曹月敏，等.胆囊幽门螺杆菌感染与胆囊壁胆囊收缩素受体mRNA表达的关系〔J〕.中华实验外科杂志，2006;23(8):931-3.

9 郝晓尊，王会生，牛建华，等.胆囊幽门螺杆菌感染与胆囊黏膜超微结构的变化〔J〕.华北煤炭医学院学报，2007;9(4):518-9.