病理性瘢痕与正常皮肤的蛋白质组学研究*

胡志成，朱家源，朱 斌，郭 栋，2，陈 斌，张 凯，胡坤华，黎明涛，唐 冰△

(1中山大学附属第一医院烧伤外科，广东 广州 510080;2中山大学附属第三医院整形外科，广东 广州 510630;3中山大学中山医学院蛋白质组学研究中心，广东 广州 510080)

病理性瘢痕主要包括瘢痕疙瘩(keloid)和增生性瘢痕(hypertrophic scar)，是人体对创伤产生过度愈合反应的结果，它们都以成纤维细胞(fibroblast，FB)过度增生、分泌大量的细胞外基质、导致胶原的过量合成和沉积为特征，其确切的发病机制仍然不清楚[1，2]。蛋白质作为发挥基因功能的载体，是生命功能的真正执行者。为此，如果寻找出疾病高敏感性和特异性的差异蛋白质，则可以对揭示病理性瘢痕形成机制提供新的思路。因此，本研究运用蛋白质组学的方法对瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮肤进行差异蛋白表达的研究，建立病理性瘢痕和正常皮肤组织的双向凝胶电泳图谱，初步筛选出病理性瘢痕相关的功能性蛋白质，为进一步揭示病理性瘢痕的形成机制和发现新的治疗靶点提供线索和依据。

材料和方法

1 临床资料

标本来自中山大学附属第一医院烧伤外科2010年1月－2010年6月手术切除的组织。瘢痕疙瘩8例，男、女各4例，年龄17－32岁;增生性瘢痕8例，男、女各4例，年龄21－38岁。病理性瘢痕的诊断标准参照参考文献[3]，经临床及病理诊断证实，且患者于手术前未进行放疗、激素或者其它治疗;正常对照皮肤3例，取自整形外科患者躯干皮肤，男性2例，女性1例，年龄22－32岁。所有的组织经液氮速冻，－80℃保存备用。所有患者均签署知情同意书。

2 材料和仪器

冰醋酸、丁醇为Merck产品;尿素、Tris碱、3－[3－(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐、二硫苏糖醇、溴酚蓝、甘油、十二烷基磺酸钠、过硫酸铵、IPG strip、IPG buffer、蛋白质纯化试剂盒、定量试剂盒、考马斯亮蓝均购自Amersham Biosciences;硫脲、除高峰度蛋白试剂盒为Sigma产品。DU530型核酸/蛋白分析仪(Beckman);IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT six大型垂直电泳系统、扫描仪ImageScanner和Lab-Scan软件(Amersham Biosciences);质谱仪Ultraflex III(Bruker);AF100型制冰机(Scotsman);Belly Dancer多维轨道摇床(Stovall);Mini Spin Plus小型台式离心机(Eppendorf);排风柜(Fisher)。

3 方法

3.1 组织提取蛋白 称取200 mg的组织物，在蔗糖中充分剪碎，点动离心，加入裂解液匀浆后超声波处理，20000×g离心30 min，取中间层液体。按蛋白质纯化试剂盒说明书方法纯化蛋白后，对蛋白浓度进行定量。

3.2 双向凝胶电泳(2D－DIGE) 将蛋白样品进行第一向电泳。IEF参数设置为:30 V、12 h(胶条再水化);500 V、1 h;1000 V、1 h;8000 V、30 min;10000 V、10 h;500V、12 h;85000 VHr收胶。IEF 结束后，在平衡缓冲液中平衡胶条。将胶条转移至12.5%浓度的SDS－PAGE胶面上行第二向电泳，参数设置为:2W/gel、12W，50 min 后改为 17 W/gel、100 W;直至胶内电泳指示剂溴酚蓝跑出凝胶下缘10 min。对凝胶按Deep Qurple说明书方法进行荧光染色。

3.3 图像采集与分析 使用 Typhoon 9400型多功能激光扫描仪对凝胶成像，用ImageQuant图像分析软件进行图谱分析。凝胶图像经识别、分析后，寻找差异点，统计分析使用Student's t－test法。选取蛋白斑点丰度差异大于4倍的蛋白质斑点、t－test P＜0.05的斑点作进一步分析。

3.4 质谱图的获取 用Spot Handling Workstation对染色的凝胶处理，取AnchorChip靶点样后在质谱上进行MALDI－TOF/TOF分析，获得肽质量指纹图谱(PMF)和利用LIFT软件将对4个强度最大峰肽段进行串级质谱分析。

3.5 质谱数据的分析 使用Biotools软件检索，以MASCOT为搜索引擎在NCBInr数据库中进行搜索，参数设置为:检索种属为human;数据检索的方式为combined;最大允许漏切位点为1;酶为胰蛋白酶。质量误差范围设置:PMF 50 ppm，MS/MS 0.5 Da。

4 统计学处理

两组间差异蛋白的比较进行t检验，检验水准设为 0.05。

结 果

1 双向电泳和图谱比较

对瘢痕疙瘩组织、增生性瘢痕组织和正常皮肤组织同时进行2D－DIGE分离，在相同条件下分别重复4次，发现瘢痕疙瘩组织、增生性瘢痕组织和正常皮肤组织凝胶电泳图谱中平均蛋白质点数分别为2978、2975和3053，将其中1块胶设定为参考胶，进行6个凝胶图谱斑点的匹配分析得到平均匹配率分别为76%、69%和78%，发现其在凝胶图谱中的位置上均有较好的重复性。根据蛋白质点表达量与所有匹配蛋白质点表达量总和的比值＞4，且同组4块胶图谱中都出现相同变化的蛋白点，被认为是差异蛋白质点，见图1。

2 质谱分析结果和蛋白质鉴定

在瘢痕疙瘩组织、增生性瘢痕组织和正常皮肤组织的2D－DIGE图谱中，选取差异蛋白质点，进行MALDI－TOF/TOF质谱分析，得到蛋白质点的肽质量指纹图(peptide mass fingerprint，PMF)后，应用PMF数据，通过Biotools查询软件搜索NCBInr数据库，进行蛋白质点的肽质量指纹谱与蛋白质数据库的比较来鉴定蛋白质。

2.1 瘢痕疙瘩与增生性瘢痕一致性分析 病理性瘢痕与正常皮肤组织相比，经质谱分析共鉴定出36种不同蛋白，其中，瘢痕疙瘩有27种(图1A)，而增生性瘢痕有25种(图1B);有16种蛋白同时表达在瘢痕疙瘩与增生性瘢痕中，包括上调蛋白8种，下调蛋白8种，见表1。

Figure1.2－D DIGE image of pathological scars，the up and down－regulated protein spots were marked.A:2－D DIGE image of keloid;B:2 －D DIGE image of hypertrophic scars.图1 病理性瘢痕双向差异凝胶电泳图

表1 瘢痕疙瘩和增生性瘢痕发生一致变化的差异表达蛋白Table1.List of consistently differentially－expressed proteins in both keloid and hypertrophic scar compared with normal skin

2.2 瘢痕疙瘩与增生性瘢痕不一致性分析

①在瘢痕疙瘩中差异表达而增生性瘢痕中无差异表达变化的蛋白，经质谱分析鉴定出11个不同蛋白，其中上调9个，下调2个，见表2。

表2 瘢痕疙瘩中特异性差异表达的基因Table2.Specific and differentially－expressed proteins in keloid but not in hypertrophic scar

②在增生性瘢痕中差异表达而瘢痕疙瘩中无差异表达变化的蛋白，经质谱分析鉴定出9个不同蛋白，其中上调4个，下调5个，见表3。

表3 增生性瘢痕中特异性差异表达的蛋白Table3.Specific and differentially－expressed proteins in hypertrophic scar but not in keloid

讨 论

瘢痕组织是人体创伤修复过程中的一种自然产物，其过度增生所形成的病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是烧伤、整形外科最常见的疾病，其发病机制尚不清楚，目前也仍然缺乏理想的防治方法。

在本次实验中，我们应用蛋白质组学技术对8组瘢痕疙瘩、8组增生性瘢痕和3组正常皮肤组织进行蛋白组学技术研究，成功建立了重复性较好的瘢痕疙瘩、增生性瘢痕与正常皮肤组织的双向凝胶电泳图谱。比较分析蛋白质表达谱后，对表达差异超过4倍的斑点进行了MALDI－TOF/TOF质谱[4]分析，建立其肽质量指纹图并对其进行了初步鉴定，获得了36个与病理性瘢痕发生、发展相关的蛋白质，包括在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中表达一致的蛋白16个，其中上调蛋白8个，下调蛋白8个;只在瘢痕疙瘩中表达的差异蛋白11个，其中上调9个，下调2个;只在增生性瘢痕中表达的差异蛋白9个，其中上调4个，下调5个。对这些异常表达的蛋白质做进一步的研究，将可能为揭示病理性瘢痕形成机制提供新的思路。

本研究中我们发现，在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中asporin均高表达。Asporin属于富含亮氨酸重复序列的小分子蛋白多糖(small leucine－rich repeat，SLRP)家族，组成皮肤细胞外基质。SLRPs是一组结构及功能相关的细胞外基质分子，作为细胞生存的大分子环境，它们在细胞迁移、生长、分化，组织修复和肿瘤生长过程中起着重要作用。目前已证实asporin可与转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF－β)形成功能性反馈环:asporin可通过与TGF－β结合，阻碍TGF－β与TGF－βⅡ型受体相互作用，从而抑制TGF－β信号通路;同时，TGF－β可通过Smads信号通路间接地诱导asporin表达[5]。目前已知TGF－β/Smads信号通路与瘢痕的形成有着密切的关系[6]。所以，我们推测asporin可能在病理性瘢痕的发生、发展中起着重要的作用。在未来的研究中，我们将会对其作进一步的研究，以确定其在瘢痕形成中的具体作用。

Osteoglycin为细胞外基质分子，也隶属富含亮氨酸小分子蛋白多糖基因家族(small leucine－rich proteoglycan，SLRP)成员[7]。目前研究表明，作为 SLRPs成员之一，osteoglycin可能抑制了胶原纤维的形成[8]。Tasheva 等[9]发现 osteoglycin 基因敲除小鼠的角膜及皮下胶原纤维层较正常小鼠显著增厚，主要是由于胶原代谢障碍引起。有学者[10]发现，急性肺栓塞后肺组织内osteoglycin mRNA和蛋白水平均逐渐降低，认为osteoglycin的表达下降导致了Ⅰ型胶原的降解减少，从而引起Ⅰ型胶原在肺间质堆积，形成肺间质纤维化的表现。本研究中发现osteoglycin在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中均呈低表达，这可能是导致病理性瘢痕胶原沉积，纤维增生的主要因素之一。其具体作用和机制有待进一步研究。

波形蛋白(vimentin)是中等纤维的主要成分之一，在成纤维细胞中起到细胞支架与网络的作用。研究发现波形蛋白的表达与瘢痕的形成与发展过程基本相同，而高表达的波形蛋白在瘢痕增生形成和挛缩中起到关键的作用[11]。应用基因芯片技术检测增生性瘢痕的基因表达，发现多个基因与增生性瘢痕的形成和收缩有关，其中波形蛋白的基因呈高表达[12]。大量资料也表明:vimentin在人类许多上皮性肿瘤如肾癌、甲状腺、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等异常表达，认为与肿瘤的局部侵润侵蚀相关[13]，这可能与瘢痕疙瘩类肿瘤特性有关。本研究中我们也发现，vimentin在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中都呈高表达。在未来的工作中，我们也将对其具体的分子生物学意义做进一步的研究。

本实验成功建立病理性瘢痕和正常皮肤组织的双向凝胶电泳图谱，鉴定出差异蛋白36个，其中瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中表达相同的蛋白16个，只在瘢痕疙瘩中差异表达蛋白11个，只在增生性瘢痕中差异表达蛋白9个。这些异常表达的蛋白在病理性瘢痕形成中可能起着重要的作用。而对其功能的深入研究，则有可能为阐明病理性瘢痕的形成机制提供新的方向，并为其治疗提供新的治疗靶点。

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