TRAF6在人PBMC来源的树突状细胞成熟中的作用*

刘 璐，李 琳，闵 军，王 捷，伍 衡，曾育杰，陈 双，褚忠华△

(中山大学孙逸仙纪念医院1胃肠外科，2妇产科，3肝胆外科，广东 广州 510120)

肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor－receptor associated factor，TRAF)是肿瘤坏死因子超家族和Toll样/白细胞介素－1受体(interleukin－1 receptor，IL－1R)超家族重要的接头分子，在天然免疫和获得性免疫中发挥了重要的作用[1]。作为细胞质中重要接头分子，TRAF6是TRAF家族中唯一能与IL－1R相关激酶、CD40等直接结合的信号分子。上述细胞因子通过TRAF6介导，调节下游信号通路，进而调节细胞的增殖及凋亡[2]。最近研究发现，TRAF6是介导树突状细胞(dendritic cells，DCs)成熟信号转导，促进DCs发育、激活与成熟的关键因子[3]。本实验通过观察TRAF6在不同成熟程度DCs的表达，进一步研究TRAF6在DCs诱导T细胞免疫中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 RPMI－1640干粉、L－glutamine、青霉素－链霉素(P－S)双抗(Gibco);胎牛血清(fetal calf serum，FCS)(杭州四季青);Ficoll淋巴细胞分离液(相对密度1.077 g/L)(Lymphoprep);重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony－stimulating factor，rhGM－CSF)、重组人白细胞介素4(interleukin－4，IL－4)、肿瘤坏死因子－α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、重组人白细胞介素 －6(IL－6)、重组人白细胞介素－1β(IL－1β)(PeproTech);藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记小鼠抗人CD83与HLADR、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记小鼠抗人CD86、CD80荧光单克隆抗体(Pharmingen);前列腺素 E2(prostaglandin－E2，PGE2)(Cayman);脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma);活细胞荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluoroscein succinimidylester，CFSE)(Molecular Probes);抗人 TRAF6抗体(Abcam);辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡Ⅱ抗(Santa Cruz);人IL－12 p40 ELISA检测试剂盒 (Diclone);Trizol Reagent(Gibco);DL 2000 DNA marker(TaKa-Ra);real－time PCR仪(Roche);UVP－GDS800紫外成像分析系统(UVI)。

1.2 人外周血样品 取自我校身体健康的大学生志愿捐献者，共5份，每份100 mL，均在献血后2 h内进行外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)分离。

2 方法

2.1 DCs的培养与诱导成熟 用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，PBS洗涤2次，用RPMI－1640完全培养基(含10%灭活胎牛血清，2 mmol/L L－谷氨酰胺，1×105U/L P－S双抗)将PBMC密度调到5×109/L，加入25 cm2培养瓶，37 ℃、5%CO2培养2 h，洗去非贴壁细胞保存备用。贴壁细胞用含1×106U/L rhGM－CSF和5×105U/L人重组IL－4的RPMI－1640完全培养基培养，第3 d加入新培养基及rhGM－CSF和IL－4。第6 d时收获未成熟DCs，按1×109/L浓度接种24孔板，每孔体积1 mL，继续用rhGM－CSF和IL－4培养，并分组诱导DCs成熟。A组:对照组，仅用rhGM－CSF和IL－4培养;B组:TNF－α诱导组，加入1×106U/L人TNF－α;C组:LPS诱导组，加入LPS 1 mg/L;D组:鸡尾酒法(Cocktail)诱导组，加入细胞因子组合(1×106U/L TNF － α，10 μg/L IL － 6，10 μg/L IL － 1β，1 mg/L PGE2)诱导成熟。各组均在诱导24 h后收获DCs，流式细胞仪进行细胞表型分析，并提取各组RNA。同时收集培养上清，－80℃保存，用于检测IL－12 p40含量。

2.2 DCs表面标志的流式细胞仪分析 用直接免疫荧光标记法标记DCs，FACS Calibur流式细胞仪(B－D)上检测成熟表型 CD80、CD83、CD86、HLA －DR，CellQuest软件分析。每个样品都用荧光标记同型IgG作为相应的阴性对照。

2.3 Western blotting检测TRAF6蛋白的表达 分别收集第7 d各组DCs(1×106/L)，考马斯亮蓝检测蛋白浓度后，以10%SDS－PAGE电泳分离样品。电泳完毕后转膜至PVDF膜，然后使用含5%脱脂奶的TBST进行封闭。加入鸡抗人TRAF6多克隆抗体后4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡Ⅱ抗常温孵育1 h。加底物TMB显色。

2.4 实时荧光定量 PCR(real－time PCR)检测TRAF6 mRNA表达 以GAPDH作为内参照，TRAF6上游引物5’－AGGAATGTAGCAGCGATGGAA－3’，下 游 引 物 5’ － AGCCCAAGAAAGTACAACAAAGAG－3’，扩增产物217 bp(由上海博亚合成)。DNase I消化基因组 DNA后，逆转录合成cDNA，进行real－time PCR反应。反应条件:95℃变性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s共40 个循环，76℃ 5 s检测荧光，75℃到95℃做融解曲线。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增情况，结果以TRAF6 mRNA在不同诱导成熟组与对照组表达量的差异倍数表示。

2.5 ELISA法检测DCs的IL－12分泌 采用双抗体夹心法检测IL－12 p40的含量，操作步骤按产品说明书进行，显色后即刻用Wellscan MK3酶标仪检测450 nm波长的吸光度(absorbance，A)值，根据标准曲线确定IL－12的含量，最小可测人IL－12 p40为20 ng/L。

2.6 混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)

①刺激细胞的获取和处理 DCs培养的第7 d分别收集各组DCs，加入丝裂霉素C混和(终浓度为25 mg/L)，37℃避光水浴30 min后，PBS离心洗涤3次，重悬细胞。

②应答细胞的获取和处理 收集2 h非贴壁的同种异体淋巴细胞，以PBS洗涤2次后加入CFSE 2.5 μmol/L染液使细胞浓度为1×1010/L。置于37℃水浴15 min，每5 min摇动1次。用RPMI－1640完全培养基中止染色，离心后重悬细胞。

③混合淋巴细胞培养 将上述刺激细胞和应答细胞按1∶10混合，以200 μL/well种至96孔 U形底细胞培养板，并设只有反应细胞的孔为对照。于37℃、5%CO2条件下培养。混合培养96 h后，收集细胞并洗涤后，送流式分析。在前散射(forward light scatter，FSC)和对侧散射(side light scatter，SSC)二维散点图中划出淋巴细胞区R，分别对每个组别这群细胞的 FL1强度进行检测，获得的数据用CellQuest软件和ModFit软件分析。

3 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析。数据以均数±标准差()表示，计数资料组间比较采用单因素方差分析。

结 果

1 各组DCs表面标志的变化

通过对第7 d后各组DCs流式检测，B、C、D组反映成熟指标的细胞表型CD80、CD83、HLA－DR均明显提高，与对照组(A组)比较差异显著(P＜0.05)，其中CD83升高最为显著(P＜0.01)。成熟表型表达最好的是鸡尾酒法组，各成熟指标均高于B、C组，其中CD83指数高达84.87%，说明鸡尾酒法诱导的DCs成熟度最佳，见图1。

Figure1.The phenotype comparison of DCs among different groups..n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.图1 各组DCs的细胞表型比较

2 Western blotting检测结果

检测培养6 d后加不同因子诱导24 h后各诱导组DC TRAF6蛋白的表达水平，B、C、D组较对照组TRAF6蛋白的表达升高，其中鸡尾酒法组TRAF6蛋白的表达量最高，见图2A。B、C、D组TRAF6蛋白的表达为(0.87±0.06，0.78±0.09，1.61±0.22)，与对照组(0.44±0.08)比较差异显著(P＜0.05)。并且B组TRAF6蛋白的表达与C、D组比较差异显著(P ＜0.05)，见图2B。

Figure2.The expression of TRAF6 protein in different groups with Western blotting assay..n=5.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.图2 Western blotting检测各组DCs TRAF6蛋白表达

3 Real－time PCR检测各组DCs TRAF6 mRNA表达水平

图3为real－time PCR定量曲线。可见当PCR反应进入对数增长期时，在同一个PCR循环期内鸡尾酒组扩增的TRAF6 mRNA实时荧光强度显著高于其它各组，说明鸡尾酒组TRAF6 mRNA扩增起始浓度高于其它各组。进一步分析看到，D组TRAF6 mRNA表达量的差异倍数(2.99±0.39)与 B组(1.01±0.34)、C组(1.37±0.20)比较差异显著(P＜0.01)。

4 各组DCs IL－12分泌量变化

Figure3.The real－time PCR amplification curves of TRAF6 mRNA in different groups.图3 各组DCs TRAF6 mRNA的扩增曲线图

采用双抗体夹心ELISA法检测各组DCs 24 h IL－12 p40分泌量，以1×106个DCs在1 mL培养液中的IL－12p40浓度表示。B、C、D组IL－12p40分泌量[(311.95±32.60)μg/L、(409.13±20.99)μg/L、(656.18±38.52)μg/L]与对照组[(142.72±21.65)μg/L]比较差异显著(P ＜0.05)，见图4。其中鸡尾酒诱导下DCs IL－12 p40分泌量显著高于B、C组(P＜0.05)。

Figure4.The IL－12 production in different groups..n=5.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.图4 各组DCs IL－12的分泌量

5 各组DCs的MLR变化

由于成熟DCs高表达共刺激分子，有较强的刺激T淋巴细胞活化增殖的能力。我们使用CFSE荧光标记淋巴细胞，当淋巴细胞分裂时，CFSE标记的荧光可平均分配至两个子代细胞中。因此在一个增殖的细胞群中，各连续子代细胞的荧光强度呈对半递减。通过CFSE法可以检测DCs对CFSE标记的淋巴细胞的刺激增殖能力，并以增殖淋巴细胞的子代占母代的比率表示。B、C、D组诱导的DCs的淋巴细胞刺激能力与对照组比较差异显著(P＜0.05)，见图5。而鸡尾酒诱导下DCs对淋巴细胞刺激能力显著高于B、C组(P＜0.05)，结果也与其DCs成熟程度与共刺激分子高表达相符合。

Figure5.Mixed leukocyte reaction..n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.图5 混合淋巴细胞反应

讨 论

研究发现，TRAF6是TRAF家族中唯一同时参与TNFR和IL－1R/TLR两个受体超家族信号转导的成员，介导不同受体转导的激活NF－κB的信号(包括IL－1、TLRs和CD40)，成为多种信号传递与相互作用的枢纽[4]。TRAF6具有独特的受体结合特异性，对于受体的识别与其它成员有明显的结构差异。IL－1R/TLRs一旦与配体结合，即通过它们的共同接头蛋白MyD88或类MyD88接头蛋白Mal，经TRAF6介导NF－κB的激活与移位，启动信号转导途径[5];而TNFR超家族成员如CD40和RANK则直接通过TRAF6激活NF－κB。此外，TRAF6在IL－25R介导的NF－κB激活与表达中起重要作用[6]。NF－κB的激活参与DCs启动成熟过程，包括增加共刺激分子CD80、CD86表达和促进炎症因子的释放。

DCs作为功能最强的专职抗原递呈细胞，在调节机体免疫反应中起核心作用。成熟DCs高表达MHC抗原肽和共刺激分子，具有刺激淋巴细胞增殖和激发免疫反应的能力。我们结果显示在不同因子诱导的成熟DCs中，鸡尾酒法诱导的DCs各项成熟表型指标最佳，特别是成熟 DCs的特征性标志CD83，其指数达到84.87。蛋白质印记检测各成熟诱导组DCs TRAF6蛋白表达均升高。为进一步准确定量不同成熟度DCs的TRAF6 mRNA的表达，我们采用real－time PCR了解各组TRAF6 mRNA的表达差异，结果显示随着DCs成熟度的不同，TRAF6 mRNA表达有明显的变化。TRAF6 mRNA表达越强则DCs的成熟度越高。说明TRAF6可能通过促进激活NF－κB上调DCs表面MHC抗原肽和共刺激分子进而诱导DCs成熟。Megas等[4]发现TRAF6基因缺失可影响细胞内NF－κB的激活。而Kobayashi等[3]研究发现TRAF6基因缺失，DCs不能上调MHC抗原肽和CD86分子表达，进一步证明TRAF6在上调DCs表面分子方面发挥了重要的作用。

DCs通过摄取、加工处理和递呈抗原，诱导T细胞分化。MLR结果显示TRAF6表达最高的鸡尾酒法诱导DCs刺激T细胞增殖能力最强。而TRAF6基因缺陷的DCs诱导T细胞增殖能力减弱[3]，因为T细胞的完全激活需要多种信号的刺激，MHC抗原肽(第一信号)和共刺激分子CD80(第二信号)对在诱导T细胞分化过程中发挥了重要的作用[7，8]。因此DCs诱导T细胞分化能力与其表面分子的上调有密切关系。

成熟DCs通过分泌IL－12，可刺激淋巴细胞增殖。我们的结果显示TRAF6表达越高，IL－12的分泌量越大。LPS等刺激因子与细胞表面TLR结合，通过蛋白MyD88激活白细胞介素－1受体相关激酶(interleukin －1 receptor－ associated kinase，IRAK)，TRAF6在此过程中发挥了重要的作用。而MyD88蛋白则是诱导DCs分泌IL－12的重要因素[3]，并且IL－12是诱导Th细胞向Th1细胞分化的关键因素[9，10]，可促进 T 细胞增殖、分化。

综上所述，TRAF6的表达与DCs的成熟程度有密切的关系，TRAF6是调节DCs成熟、分化和激活的关键因素。特异性干预TRAF6的表达，可望有效抑制DCs的成熟。

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