IL－18基因修饰对肺癌细胞来源exosome诱导杀伤肿瘤细胞作用的影响*

张在云，李晓梅，王涓冬，孙建华，姜玉华△，潘祥林

(山东大学第二医院1肿瘤防治中心，2血液内科，山东 济南 250033)

肺癌的发病率和死亡率高，目前居恶性肿瘤死因的首位。生物免疫治疗是肺癌治疗的重要手段，exosome疫苗在多种肿瘤中显示了抗肿瘤作用，受到普遍关注，但eoxosme疫苗的疗效有待于进一步提高。白细胞介素18(interleukin 18，IL-18)具有强大的免疫刺激功能，IL－18基因修饰能增强肿瘤疫苗的疗效[1]，但IL－18基因修饰否能增强肺癌细胞来源exosome诱导的抗肿瘤作用尚不清楚。肿瘤细胞来源的exosome含有肿瘤抗原，能够刺激树突状细胞(dendritic cells，DC)诱导活化T细胞而产生抗肿瘤作用[2]，是exosome疫苗重要来源。为此，本文旨在研究IL－18基因修饰的NCI-H460肺癌细胞来源exosome诱导活化T细胞对肺癌细胞的杀伤作用，为获得高效的exosome疫苗作初步探讨。

材料和方法

1 主要材料及仪器

RPMI-1640培养液 (Gibco);蔗糖、重水(Sigma);超滤离心管(Millipore);鼠抗人热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、人白细胞抗原(human leukocyte antigtn，HLA)及 IL-18 抗体(Santa Cruz);辣根酶标记兔抗鼠 IgG(Santa Cruz);ECL(Santa Cruz);LDH试剂盒(南京建成生物工程公司);IL-18和pcDNA3.1+载体修饰的NCI-H460细胞由本实验室保存。CO2培养箱(Format);超速冷冻离心机(55P-72型，日立)，TEM-100X透射电镜(日立);电泳仪及凝胶成像仪(Bio-Rad);紫外分光光度仪(Hewlett-Packard)。

2 Exosome的提取及电镜观察

将IL-18基因修饰的NCI-H460细胞(IL-18/H460)、pcDNA3.1+载体修饰细胞(DNA3.1/H460)及未修饰NCI-H460细胞(NCI-H460)用RPMI-1640培养液培养，收集上清液，用差速离心法提取exosome。细胞培养上清液1000×g，离心10 min;取上清，10000×g离心10 min;取上清液，将30%蔗糖/重水垫、上清液及PBS依次放入离心管中，100000×g，离心1 h;取混有exosome的蔗糖/重水垫，用PBS悬浮，加入到100 kD超滤离心管中，重复3次，浓缩液即为exosome，用0.22 μm的滤膜过滤除菌，放入-80℃冰箱中保存备用。

取exosome 20 μL，滴于载样铜网上，室温静置1 min，用滤纸吸干液体，滴加20 g/L磷钨酸负染1 min，用滤纸吸干负染液，用白炽灯烤干，透射电镜下观察形态。

3 Exosome蛋白分析

将exosome经超声冲击破膜，用Western blotting方法检测exosome中HSP70、HLA及IL-18的表达。取20 μg用SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭1h，加入鼠抗人 HSP70、HLA、IL-18抗体，再加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体，进行ECL反应显影，在Bio-Rad凝胶成像仪中观察分析结果。

4 Exosome诱导活化的T细胞对肺癌细胞的杀伤作用

分离人外周血T细胞，在T细胞中加入10 μg exosome培养72 h，为exosome直接刺激活化的T细胞。用人外周血单个核细胞诱导培养DC[3]，将成熟DC加入exosome 10 μg培养24 h，再将DC与T细胞按1∶10混合培养72 h，为exosome冲击DC活化的T细胞。以活化T细胞为效应细胞(E)，NCI-H460细胞为靶细胞(T)，设反应孔、最大释放孔及自然释放孔，反应孔含效应细胞和靶细胞，自然释放孔只加靶细胞，最大释放孔加Triton X-1002 μL，按乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒说明书用LDH 法测定效靶比分别为 25∶1、10∶1、5∶1 时活化 T细胞对NCI-H460细胞的杀伤作用，计算杀伤率。

5 统计学处理

结 果

1 Exosome的电镜观察及蛋白分析

3组细胞上清液经差速离心法提取exosome，透射电镜下观察到exosome呈囊泡状，圆球形，大小不一，直径在30-150 nm之间，3组exosome的形态、大小无显著差异。用Western blotting方法检测exosome中HSP70、HLA及IL-18的表达，结果3组细胞exosome均有HSP70及HLA蛋白表达。IL-18/H460组exosome有IL-18蛋白的表达，而其余2组未见IL-18蛋白表达，见图1。

Figure1.HSP70，HLA and IL-18 proteins in exosomes of the 3 groups(IL-18/H460，DNA3.1/H460，and NCIH460)were detected by Western blotting.HSP70 and HLA proteins were detected in exosomes of all the 3 groups，and IL-18 protein was observed only in IL-18/H460 group.图1 Exosome中HSP70、HLA及IL－18蛋白表达

2 Exosome刺激的T细胞对NCI－H460细胞的杀伤作用

用3组细胞exosome直接刺激T细胞，用LDH法检测T细胞对NCI-H460细胞的杀伤作用。结果在效靶比25∶1、10∶1、5∶1 时，IL-18/H460 组杀伤率为(38.45±5.42)%、(25.17±3.94)%和(11.75±3.22)%，效靶比25∶1和10∶1时高于DNA3.1/H460组(P＜0.05)及NCI-H460组(P＜0.05)，后2组之间杀伤率无显著差异。IL-18/H460组杀伤率随效应细胞比例增加而提高，效靶比25∶1时杀伤率高于10∶1(P ＜0.05)及5∶1时(P ＜0.05)，见图2。

3 Exosome冲击DC活化的T细胞对NCI－H460细胞的杀伤作用

将3组细胞exosome冲击DC，再用DC活化T细胞，检测其对NCI-H460细胞的杀伤作用。在效靶比25∶1、10∶1、5∶1 时 IL-18/H460 组杀伤率为(89.05±4.06)%、(64.97±6.02)%和(40.16±4.98)%，均高于DNA3.1/H460组(P＜0.05)及NCI-H460组(P＜0.05)，后2组之间无显著差异。IL-18/H460组效靶比25∶1时杀伤作用最强，10∶1时次之，5∶1 时作用最弱，见图3。

Figure2.The lethal effects of exosome-activated T cells on NCI-H460 lung cancer cells(LDH method).The killing rates of IL-18/H460 group at E∶T ratio of 25∶1，10∶1 and 5∶1 were higher than those in DNA3.1/H460 and NCI-H460 groups..n=6.△P ＜0.05 vs IL-18/H460.E∶T =effector cell∶target cell.图2 Exosome刺激的T细胞对NCI－H460细胞的杀伤作用

Figure3.The lethal effects of exosome-pulsed DC-activated T cells on NCI-H460 lung cancer cells(LDH method).The killing rates of IL-18/H460 group at E∶T ratio of 25∶1，10∶1 and 5∶1 were higher than those in DNA3.1/H460 and NCI-H460 groups..n=6.△P ＜0.05 vs IL-18/H460.图3 Exosome冲击DC活化的T细胞对NCI－H460细胞的杀伤作用

4 Exosome冲击DC活化的T细胞与exosome直接刺激的T细胞杀伤肿瘤细胞作用比较

将exosome冲击DC活化的T细胞杀伤作用与exosome直接刺激T细胞的杀伤作用相比较，前者在效靶比25∶1、10∶1、5∶1 时其 IL-18/H460 组杀伤率均高于后者(P＜0.05)，表明用IL－18基因修饰的NCI-H460细胞来源的exosome诱导抗肿瘤作用时，exosome冲击DC活化的T细胞杀伤作用强于exosome直接刺激活化的T细胞，见图4。

Figure4.Comparison of the anti-tumor efficacy between exosome-pulsed DC-activated T cells and exosomestimulated T cells in IL-18/H460 group.The killing rates of exosome-pulsed DC-activated T cells at E∶T ratio of 25∶1，10∶1 and 5∶1 were higher than those of exosome-stimulated T cells..n=6.△P＜0.05 vsexosome-DC.图4 Exosome冲击DC活化的T细胞与exosome直接刺激的T细胞杀伤肿瘤细胞作用比较

讨 论

Exosome最初用来描述网织红细胞分泌的一种膜小泡，后来发现B淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞、肠上皮细胞和肿瘤细胞等多种细胞可分泌exosome[4，5]，它来源于细胞的多泡体，是由多泡体的泡膜与质膜融合后释放到胞外空间的小泡，由脂质双分子层膜包被，直径为30-100 nm，呈蝶形或球形。Exosome含有丰富的蛋白质，不同细胞来源的exosome所含的蛋白质不同，其生物学功能也有差异。肿瘤细胞来源的exosome含有MHC-Ⅰ类分子、热休克蛋白、肿瘤特异性抗原及肿瘤共同抗原，可以作为一种抗原载体，将肿瘤抗原转移到抗原提呈细胞，并具有交叉提呈作用[6]。杀伤性T细胞是抗肿瘤免疫治疗的关键细胞，T细胞的活化需要有肿瘤抗原，抗原呈递、共刺激分子等，exosome含肿瘤抗原和抗原呈递所需物质，本身可以呈递抗原，活化T细胞，因而是exosome肿瘤疫苗的重要来源。应用肿瘤细胞来源的exosome构建肿瘤疫苗，可以通过exosome冲击DC而诱导活化T细胞，也可由exosome直接刺激活化T细胞，发挥抗肿瘤作用[7，8]。本研究比较了NCI-H460细胞来源的exosome经冲击DC后活化T细胞与直接刺激活化T细胞对肺癌细胞的杀伤作用，结果exosome直接刺激活化的T细胞显示了对肺癌细胞的杀伤作用，但杀伤效力较exosome冲击DC后活化的T细胞明显减弱，表明了DC在exosome肿瘤疫苗中的关键地位。

目前的exosome疫苗虽然显示了一定的抗肿瘤作用，但其效力有待于增强。IL-18是功能强大的细胞因子，可诱导TNF-α、GM-CSF和 IFN-γ等细胞因子的产生，调节T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和DC的活性，在抗肿瘤和机体的免疫调节等方面具有重要作用[9]，研究显示IL－18基因修饰能够增强DC的活性和免疫刺激能力[10]。我们研究了IL－18基因修饰的NCI-H460细胞来源exosome诱导的T细胞对肺癌细胞的杀伤作用，以pcDNA3.1+修饰的NCI-H460细胞与未修饰的NCI-H460细胞为对照，结果IL-18基因修饰组作用明显强于对照组，而后二者之间作用无显著差异，因而排除了基因转染过程的干扰因素。这表明IL-18基因修饰可以增强肺癌细胞来源exosome诱导的抗肿瘤作用，为IL-18与exosome疫苗联合用于肺癌治疗提供了理论依据，但其作用机制尚待进一步阐明。

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