APP下载

IL-18基因修饰对肺癌细胞来源exosome诱导杀伤肿瘤细胞作用的影响*

2011-08-02张在云李晓梅王涓冬孙建华姜玉华潘祥林

中国病理生理杂志 2011年9期
关键词:基因修饰来源抗原

张在云,李晓梅,王涓冬,孙建华,姜玉华△,潘祥林

(山东大学第二医院1肿瘤防治中心,2血液内科,山东 济南 250033)

肺癌的发病率和死亡率高,目前居恶性肿瘤死因的首位。生物免疫治疗是肺癌治疗的重要手段,exosome疫苗在多种肿瘤中显示了抗肿瘤作用,受到普遍关注,但eoxosme疫苗的疗效有待于进一步提高。白细胞介素18(interleukin 18,IL-18)具有强大的免疫刺激功能,IL-18基因修饰能增强肿瘤疫苗的疗效[1],但IL-18基因修饰否能增强肺癌细胞来源exosome诱导的抗肿瘤作用尚不清楚。肿瘤细胞来源的exosome含有肿瘤抗原,能够刺激树突状细胞(dendritic cells,DC)诱导活化T细胞而产生抗肿瘤作用[2],是exosome疫苗重要来源。为此,本文旨在研究IL-18基因修饰的NCI-H460肺癌细胞来源exosome诱导活化T细胞对肺癌细胞的杀伤作用,为获得高效的exosome疫苗作初步探讨。

材料和方法

1 主要材料及仪器

RPMI-1640培养液 (Gibco);蔗糖、重水(Sigma);超滤离心管(Millipore);鼠抗人热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)、人白细胞抗原(human leukocyte antigtn,HLA)及 IL-18 抗体(Santa Cruz);辣根酶标记兔抗鼠 IgG(Santa Cruz);ECL(Santa Cruz);LDH试剂盒(南京建成生物工程公司);IL-18和pcDNA3.1+载体修饰的NCI-H460细胞由本实验室保存。CO2培养箱(Format);超速冷冻离心机(55P-72型,日立),TEM-100X透射电镜(日立);电泳仪及凝胶成像仪(Bio-Rad);紫外分光光度仪(Hewlett-Packard)。

2 Exosome的提取及电镜观察

将IL-18基因修饰的NCI-H460细胞(IL-18/H460)、pcDNA3.1+载体修饰细胞(DNA3.1/H460)及未修饰NCI-H460细胞(NCI-H460)用RPMI-1640培养液培养,收集上清液,用差速离心法提取exosome。细胞培养上清液1000×g,离心10 min;取上清,10000×g离心10 min;取上清液,将30%蔗糖/重水垫、上清液及PBS依次放入离心管中,100000×g,离心1 h;取混有exosome的蔗糖/重水垫,用PBS悬浮,加入到100 kD超滤离心管中,重复3次,浓缩液即为exosome,用0.22 μm的滤膜过滤除菌,放入-80℃冰箱中保存备用。

取exosome 20 μL,滴于载样铜网上,室温静置1 min,用滤纸吸干液体,滴加20 g/L磷钨酸负染1 min,用滤纸吸干负染液,用白炽灯烤干,透射电镜下观察形态。

3 Exosome蛋白分析

将exosome经超声冲击破膜,用Western blotting方法检测exosome中HSP70、HLA及IL-18的表达。取20 μg用SDS-PAGE凝胶电泳,将蛋白电转移至硝酸纤维素膜,室温封闭1h,加入鼠抗人 HSP70、HLA、IL-18抗体,再加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体,进行ECL反应显影,在Bio-Rad凝胶成像仪中观察分析结果。

4 Exosome诱导活化的T细胞对肺癌细胞的杀伤作用

分离人外周血T细胞,在T细胞中加入10 μg exosome培养72 h,为exosome直接刺激活化的T细胞。用人外周血单个核细胞诱导培养DC[3],将成熟DC加入exosome 10 μg培养24 h,再将DC与T细胞按1∶10混合培养72 h,为exosome冲击DC活化的T细胞。以活化T细胞为效应细胞(E),NCI-H460细胞为靶细胞(T),设反应孔、最大释放孔及自然释放孔,反应孔含效应细胞和靶细胞,自然释放孔只加靶细胞,最大释放孔加Triton X-1002 μL,按乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒说明书用LDH 法测定效靶比分别为 25∶1、10∶1、5∶1 时活化 T细胞对NCI-H460细胞的杀伤作用,计算杀伤率。

5 统计学处理

结 果

1 Exosome的电镜观察及蛋白分析

3组细胞上清液经差速离心法提取exosome,透射电镜下观察到exosome呈囊泡状,圆球形,大小不一,直径在30-150 nm之间,3组exosome的形态、大小无显著差异。用Western blotting方法检测exosome中HSP70、HLA及IL-18的表达,结果3组细胞exosome均有HSP70及HLA蛋白表达。IL-18/H460组exosome有IL-18蛋白的表达,而其余2组未见IL-18蛋白表达,见图1。

Figure1.HSP70,HLA and IL-18 proteins in exosomes of the 3 groups(IL-18/H460,DNA3.1/H460,and NCIH460)were detected by Western blotting.HSP70 and HLA proteins were detected in exosomes of all the 3 groups,and IL-18 protein was observed only in IL-18/H460 group.图1 Exosome中HSP70、HLA及IL-18蛋白表达

2 Exosome刺激的T细胞对NCI-H460细胞的杀伤作用

用3组细胞exosome直接刺激T细胞,用LDH法检测T细胞对NCI-H460细胞的杀伤作用。结果在效靶比25∶1、10∶1、5∶1 时,IL-18/H460 组杀伤率为(38.45±5.42)%、(25.17±3.94)%和(11.75±3.22)%,效靶比25∶1和10∶1时高于DNA3.1/H460组(P<0.05)及NCI-H460组(P<0.05),后2组之间杀伤率无显著差异。IL-18/H460组杀伤率随效应细胞比例增加而提高,效靶比25∶1时杀伤率高于10∶1(P <0.05)及5∶1时(P <0.05),见图2。

3 Exosome冲击DC活化的T细胞对NCI-H460细胞的杀伤作用

将3组细胞exosome冲击DC,再用DC活化T细胞,检测其对NCI-H460细胞的杀伤作用。在效靶比25∶1、10∶1、5∶1 时 IL-18/H460 组杀伤率为(89.05±4.06)%、(64.97±6.02)%和(40.16±4.98)%,均高于DNA3.1/H460组(P<0.05)及NCI-H460组(P<0.05),后2组之间无显著差异。IL-18/H460组效靶比25∶1时杀伤作用最强,10∶1时次之,5∶1 时作用最弱,见图3。

Figure2.The lethal effects of exosome-activated T cells on NCI-H460 lung cancer cells(LDH method).The killing rates of IL-18/H460 group at E∶T ratio of 25∶1,10∶1 and 5∶1 were higher than those in DNA3.1/H460 and NCI-H460 groups..n=6.△P <0.05 vs IL-18/H460.E∶T =effector cell∶target cell.图2 Exosome刺激的T细胞对NCI-H460细胞的杀伤作用

Figure3.The lethal effects of exosome-pulsed DC-activated T cells on NCI-H460 lung cancer cells(LDH method).The killing rates of IL-18/H460 group at E∶T ratio of 25∶1,10∶1 and 5∶1 were higher than those in DNA3.1/H460 and NCI-H460 groups..n=6.△P <0.05 vs IL-18/H460.图3 Exosome冲击DC活化的T细胞对NCI-H460细胞的杀伤作用

4 Exosome冲击DC活化的T细胞与exosome直接刺激的T细胞杀伤肿瘤细胞作用比较

将exosome冲击DC活化的T细胞杀伤作用与exosome直接刺激T细胞的杀伤作用相比较,前者在效靶比25∶1、10∶1、5∶1 时其 IL-18/H460 组杀伤率均高于后者(P<0.05),表明用IL-18基因修饰的NCI-H460细胞来源的exosome诱导抗肿瘤作用时,exosome冲击DC活化的T细胞杀伤作用强于exosome直接刺激活化的T细胞,见图4。

Figure4.Comparison of the anti-tumor efficacy between exosome-pulsed DC-activated T cells and exosomestimulated T cells in IL-18/H460 group.The killing rates of exosome-pulsed DC-activated T cells at E∶T ratio of 25∶1,10∶1 and 5∶1 were higher than those of exosome-stimulated T cells..n=6.△P<0.05 vsexosome-DC.图4 Exosome冲击DC活化的T细胞与exosome直接刺激的T细胞杀伤肿瘤细胞作用比较

讨 论

Exosome最初用来描述网织红细胞分泌的一种膜小泡,后来发现B淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞、肠上皮细胞和肿瘤细胞等多种细胞可分泌exosome[4,5],它来源于细胞的多泡体,是由多泡体的泡膜与质膜融合后释放到胞外空间的小泡,由脂质双分子层膜包被,直径为30-100 nm,呈蝶形或球形。Exosome含有丰富的蛋白质,不同细胞来源的exosome所含的蛋白质不同,其生物学功能也有差异。肿瘤细胞来源的exosome含有MHC-Ⅰ类分子、热休克蛋白、肿瘤特异性抗原及肿瘤共同抗原,可以作为一种抗原载体,将肿瘤抗原转移到抗原提呈细胞,并具有交叉提呈作用[6]。杀伤性T细胞是抗肿瘤免疫治疗的关键细胞,T细胞的活化需要有肿瘤抗原,抗原呈递、共刺激分子等,exosome含肿瘤抗原和抗原呈递所需物质,本身可以呈递抗原,活化T细胞,因而是exosome肿瘤疫苗的重要来源。应用肿瘤细胞来源的exosome构建肿瘤疫苗,可以通过exosome冲击DC而诱导活化T细胞,也可由exosome直接刺激活化T细胞,发挥抗肿瘤作用[7,8]。本研究比较了NCI-H460细胞来源的exosome经冲击DC后活化T细胞与直接刺激活化T细胞对肺癌细胞的杀伤作用,结果exosome直接刺激活化的T细胞显示了对肺癌细胞的杀伤作用,但杀伤效力较exosome冲击DC后活化的T细胞明显减弱,表明了DC在exosome肿瘤疫苗中的关键地位。

目前的exosome疫苗虽然显示了一定的抗肿瘤作用,但其效力有待于增强。IL-18是功能强大的细胞因子,可诱导TNF-α、GM-CSF和 IFN-γ等细胞因子的产生,调节T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和DC的活性,在抗肿瘤和机体的免疫调节等方面具有重要作用[9],研究显示IL-18基因修饰能够增强DC的活性和免疫刺激能力[10]。我们研究了IL-18基因修饰的NCI-H460细胞来源exosome诱导的T细胞对肺癌细胞的杀伤作用,以pcDNA3.1+修饰的NCI-H460细胞与未修饰的NCI-H460细胞为对照,结果IL-18基因修饰组作用明显强于对照组,而后二者之间作用无显著差异,因而排除了基因转染过程的干扰因素。这表明IL-18基因修饰可以增强肺癌细胞来源exosome诱导的抗肿瘤作用,为IL-18与exosome疫苗联合用于肺癌治疗提供了理论依据,但其作用机制尚待进一步阐明。

[1]Cao DY,Yang JY,Dou KF,et al.Alpha-fetoprotein and interleukin-18 gene-modified dendritic cells effectively stimulate specific type-1 CD4-and CD8-mediated T-cell response from hepatocellular carcinoma patients in vitro[J].Hum Immunol,2007,68(5):334-341.

[2]张家模,吴小候,张 尧,等.膀胱移行细胞癌来源的exosome诱导体外细胞毒性T细胞杀伤效应[J].中华肿瘤杂志,2009,31(10):738-741.

[3]傅永强,张在云,李旭升,等.白细胞介素-18干预诱导的树突状细胞表型和活性研究[J].中国病理生理杂志,2008,24(7):1414-1417.

[4]Viaud S,Théry C,Ploix S,et al.Dendritic cell-derived exosomes for cancer immunotherapy:what's next?[J].Cancer Res,2010,70(4):1281-1285.

[5]Saunderson SC,Schuberth PC,Dunn AC,et al.Induction of exosome release in primary B cells stimulated via CD40 and the IL-4 receptor[J].J Immunol,2008,180(12):8146-8152.

[6]Clayton A,Mitchell JP,Court J,et al.Human tumorderived exosomes down-modulate NKG2D expression[J].J Immunol,2008,180(11):7249-7258.

[7]Hao S,Bai O,Li F,et al.Mature dendritic cells pulsed with exosomes stimulate efficient cytotoxic T-lymphocyte responses and antitumour immunity[J].Immunology,2007,120(1):90-102.

[8]Tan A,De La Peña H,Seifalian AM.The application of exosomes as a nanoscale cancer vaccine[J].Int J Nanomedicine,2010,5:889-900.

[9]Nakanishi K,Tsutsui H,Yoshimoto T.Importance of IL-18-induced super Th1 cells for the development of allergic inflammation[J].Allergol Int,2010,59(2):137-141.

[10]张在云,吴金民.白细胞介素18基因转染的肺癌细胞对树突状细胞免疫特性的影响[J].中国病理生理杂志,2007,23(4):794-798.

猜你喜欢

基因修饰来源抗原
将来吃鱼不用调刺啦
首个基因修饰有袋类动物培育成功
Nurr1基因修饰胚胎中脑神经干细胞移植治疗帕金森病
负载抗原DC联合CIK对肝癌免疫微环境的影响
hPlGF-2基因修饰的骨髓间充质干细胞对皮肤创伤修复及血管形成的作用研究
试论《说文》“丵”字的来源
“赤”的来源与“红”在服装中的应用
骨形态发生蛋白4基因修饰的脂肪来源干细胞复合藻酸钙凝胶支架修复关节软骨的实验研究
结核分枝杆菌抗原Lppx和MT0322人T细胞抗原表位的多态性研究
APOBEC-3F和APOBEC-3G与乙肝核心抗原的相互作用研究