低氧－复氧对人鼻咽癌细胞增殖、细胞周期、黏附和侵袭能力的影响*

杨海峰， 朱林燕， 郑广娟， 陈丽新， 王立伟， 林 熙， 唐慰萍

(1广州中医药大学第二附属医院，广东省中医院病理科，广东 广州 510120;暨南大学医学院2药理学系，3生理学系，广东 广州 510632;4广东医学院病理学教研室，广东 湛江 524023)

低氧是实体瘤微环境中一个重要的病理生理学特征。当实体瘤直径达1－2 mm时，血液循环中的氧难以到达肿瘤中心导致肿瘤低氧(tumor hypoxia)［1］，而肿瘤新生血管的建立可使肿瘤低氧区域重新获得氧的供应(reoxygenation)。因而肿瘤微环境表现为周期性的低氧 －复氧(hypoxia－reoxygenation，H－R)。研究显示:H－R可诱导肿瘤细胞产生适应性变化，肿瘤基因组不稳定性增加，由此产生的新的肿瘤变异型甚至对低氧有更好的生存适应能力［2，3］。鼻咽癌是一种高发于我国南方地区的恶性肿瘤，其原发瘤及颈部淋巴结转移瘤的微环境中都有低氧的表现。我们前期研究发现，低氧可诱导鼻咽癌细胞(CNE－2Z)血管内皮生长因子表达增加［4］，这一机制可能促进肿瘤血管生成，恢复肿瘤供氧。在此，我们通过研究CNE－2Z细胞在H－R后其增殖能力和细胞周期进程的改变，以及H－R对细胞黏附、侵袭和转移能力的影响，探讨微环境HR对鼻咽癌细胞生物学特性影响的规律。

材料和方法

1 细胞培养

低分化人鼻咽细胞株CNE－2Z(本室建株并保存)培养于含10%新生牛血清(Gibco)、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI－1640(Gibco)培养液中，预先在37℃、20%O2和5%CO2(常氧)环境中培养24 h使细胞进入对数生长期，更换新鲜培养液进行低氧和复氧实验，并设立常氧对照组。低氧环境的建立参照文献［4］:将细胞置于培养箱独立的密闭小室，先输入纯氮(99.99%)30 min(流量5 L/min)以置换装置内的残余O2;然后输入混合气(95%N2、5%CO2和 ＜0.1%O2)30 min(流量 5 L/min)，使气体达到平衡后减小混合气流量为0.2 L/min，维持装置内低氧状态。

2 MTT法检测细胞增殖

CNE－2Z细胞以5×106/L的密度接种到96孔培养板，每孔200 μL，细胞贴壁8 h(以此时点A值为测量基点)。在培养24 h(生长曲线第1 d)后开始低氧和复氧实验，并设立常氧对照组，低氧处理时间为24 h(生长曲线第2 d)。低氧实验处理结束后，更换新鲜培养液后在常氧条件下继续复氧培养4 d(相当于生长曲线第3－6 d)。在上述每个时点分别加入MTT，培养 4 h，去培养液，加入 DMSO 100 μL/well，轻轻振荡5 min后，全自动酶标仪测定570 nm波长的吸光度值。计算A比值(A比值=A570/8 h A570)，以A比值为纵座标，培养时间为横座标，绘制细胞生长曲线。

3 流式细胞术测定细胞周期

CNE－2Z细胞进行低氧和复氧实验，并设立常氧对照组，分别在低氧24 h(H组)、复氧8 h(H－R8组)和复氧24 h(H－R24组)时点收集细胞，碘化丙啶染色，流式细胞仪检测细胞周期。

4 同质黏附实验

分组:常氧组(N组)，低氧组(H组)，低氧复氧6 h(H－R6)，低氧复氧12 h组(H－R12)，低氧复氧24 h组(H－R24)。制备黏附系统:以4.0×104/well细胞密度接种于96孔培养板，置于5%CO2、21%O2、37℃环境中培养24 h，使细胞铺满孔底，不留空隙，更换新鲜培养液，分别予以分组中的不同处理因素。Trypsin－EDTA消化制备细胞悬液，以不含无血清的RPMI－1640洗涤1次。台盼蓝染色作活细胞计数，用无血清RPMI－1640稀释，制备5.0×108/L的细胞悬液。细胞悬液按150 μL/well加入黏附系统，孵育4 h。以200 r/min振摇5 min。吸取培养孔中未黏附的细胞，台盼蓝染色计数，计算细胞同质黏附率:

5 细胞－基质黏附实验

分组同上。制备黏附系统:Matrigel® (Becton Dickinson Labware)以无血清 RPMI－1640稀释至100 mg/L后按50 μL/well加入96孔细胞培养板，置于超净工作台过夜风干。临用前按100 μl/well加入无血清RPMI－1640培养液，室温静置90 min后吸去液体以去除未结合的Matrigel®。CNE－2Z细胞培养24 h至指数生长期，更换新鲜培养液，分别施加上述分组中的不同处理因素。Trypsin－EDTA消化制备细胞悬液，以不含小牛血清的RPMI－1640洗涤3次。台盼蓝染色作活细胞计数，用无血清RPMI－1640稀释，制备4.0×108/L的细胞悬液，按100 μL/well加入黏附系统，置于5%CO2、37℃环境中孵育2 h;终止孵育，吸去未黏附细胞，加入100 μL/well结晶紫染液染色10 min;温PBS洗涤4次，每次3 min;将培养板置于37℃干燥;加入醋酸－乙醇溶液100 μL/well，混匀后静置10 min。酶标仪570 nm测定吸光度值。以吸光度值大小表示细胞－基质黏附力。

6 细胞体外侵袭实验

在实验前预先以稀释的Matrigel®铺入Transwell® (直径6.5 mm，孔径8.0 μm，Corning)制备体外细胞侵袭系统。

制备5×108/L的细胞悬液(H－R组细胞预先经过24 h低氧及随后进行的24 h复氧处理)，按100 μL/well加入 Transwell®上室进行侵袭实验24 h。常氧组(N)和低氧复氧组(H－R)实验在常氧环境中进行，低氧组(H)实验在低氧环境中进行。

实验结束后，弃去孔内培养液，甲醇∶丙酮(1∶1)固定10 min。以湿润的棉签拭去聚碳酸酯滤膜正面(靠近上室面)的细胞。常规HE染色，中性树胶封片。显微镜下计数穿越人工基底膜Matrigel®，到达聚碳酸酯滤膜至反面的细胞数，每个Transwell®计数滤膜中央的5个连续高倍视野，以每视野细胞平均数代表侵袭能力。每次实验设重复孔，重复3次。

7 统计学处理

结 果

1 低氧对CNE－2Z细胞增殖的可逆性抑制作用

如图1所示，与常氧对照组比较，低氧处理24 h(相当于生长曲线第2 d)后，A相对值较常氧对照组低，二者比较差异显著(P＜0.01)。复氧培养24 h后(相当于生长曲线第3 d)A值较低氧处理结束时(第2 d)有所增加(P＜0.01)。在此之后(生长曲线第3－5 d)，与常氧对照组比较，低氧复氧组A值呈现快速升高的趋势，表现为生长曲线坡度的显著抬升，直至复氧后第5 d(生长曲线第6 d)，低氧复氧组A值与常氧对照组相比无显著差异(P＞0.05)。

Figure 1.Effect of hypoxia－reoxygenation on growth curves of CNE－2Z cells..n=18.＊＊P＜0.01 vs normoxia.图1 低氧－复氧对CNE－2Z细胞生长曲线的影响

2 低氧－复氧对CNE－2Z细胞周期的影响

如图2和表1所示，H－R影响了细胞周期分布。低氧处理24 h，细胞G1期比例明显增加，达到(73.6±2.7)%，与对照组 G1期比例［(62.6 ±4.6)%］相比，差异显著(P＜0.01)。复氧8 h，G1期细胞比例显著下降，而S期细胞比例显著增加，与常氧对照组和低氧处理组比较差异显著(P＜0.01)。复氧后24 h，细胞周期的分布已经恢复至接近正常对照组水平。流式细胞术测定H－R处理后未见明显的凋亡峰，见图2。

3 低氧－复氧对CNE－2Z细胞同质黏附能力的影响

低氧处理24 h后，CNE－2Z细胞同质黏附率为(24.17±10.39)%，低于常氧对照组的(47.99±7.41)%，差异显著(P＜0.01)。复氧后同质黏附能力较低氧组有显著增加，在复氧6、12 h同质黏附率分别为(46.68±9.08)%和(45.43±5.30)%，与低氧组比较差异均显著(P＜0.01)，见图3。然而与常氧对照组相比无显著差异(P＞0.05)。

Figure 2.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell cycle of CNE －2Z cells.A:normoxia;B:hypoxia for 24 h;C:reoxygenation for 8 h;D:reoxygenation for 24 h.图2 低氧－复氧对CNE－2Z细胞周期的影响

表1 低氧－复氧对CNE－2Z细胞系细胞周期分布的影响Table 1.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell cycle distribution of CNE－2Z cells()

表1 低氧－复氧对CNE－2Z细胞系细胞周期分布的影响Table 1.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell cycle distribution of CNE－2Z cells()

＊＊P ＜0.01 vs N;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs H.N:normoxia;H:hypoxia for 24 h;H－R8:reoxygenation for 8 h;H－R24:reoxygenation for 24 h.

N 8 62.6 ±4.6 12.4 ±3.1 25.0 ±4.1 H 3 73.6 ±2.7＊＊ 5.9 ±3.6＊＊ 20.8 ±5.8 H － R8 3 46.9 ±1.7＊＊## 9.1 ±1.6# 44.0 ±0.1＊＊##H － R24 4 60.6 ±3.3## 12.9 ±1.0## 26.6 ±2.6#

Figure 3.Effect of hypoxia－reoxygenation on homotypic adhesion of CNE－2Z cells..n=8.＊＊P＜0.01 vs normoxia，H－R6，H－R12 and H－R24.图3 低氧－复氧对CNE－2Z细胞同质黏附力的影响

4 低氧－复氧对CNE－2Z细胞细胞－基质黏附能力的影响

如图4所示，低氧处理组平均光密度值为0.943±0.055，稍低于常氧对照组0.973±0.042，但是二者比较无显著差异(P＞0.05);复氧6、12、24 h组平均吸光度值分别为1.246±0.052、1.336±0.065和1.668±0.085，均高于常氧对照组，与常氧对照组比较差异显著(P＜0.01)。复氧12 h组与复氧6 h组，复氧24 h组与复氧12 h组分别进行两两比较，差异显著(P＜0.01)。

5 低氧－复氧对CNE－2Z细胞体外侵袭能力的影响

Transwell体外侵袭实验显示，低氧处理组侵袭细胞数为(33.8±2.7)个/HPF，常氧对照组侵袭细胞数为(51.6±3.3)个/HPF，H－R组侵袭细胞数为(62.5±3.0)个/HPF，方差分析显示组间有显著差异(n=6，P＜0.01)。

讨 论

Figure 4.Effect of hypoxia－reoxygenation on cell－matrix adhesion of CNE－2Z cells..n=15.＊＊P＜0.01 vs normoxia and hypoxia.图4 低氧－复氧对CNE－2Z细胞－基质黏附力的影响

Figure 5.Effect of hypoxia on invasion ability of CNE－2Z cells in vitro..n=6.A:normoxia;B:hypoxia for 24 h;C:reoxygenation for 24 h.图5 低氧对CNE－2Z细胞侵袭能力的影响

肿瘤组织低氧是肿瘤细胞快速生长以及肿瘤新生血管在结构和功能上紊乱的结果。在实体瘤中，肿瘤细胞的生长速度大于其营养血管的生长速度，受渗透能力的限制，远离血管的肿瘤细胞无法得到充足的氧供应，表现为肿瘤低氧［1］。近年来低氧与肿瘤关系得到研究者的重视。一系列的研究表明，低氧可以改变肿瘤细胞低氧目的基因(hypoxia target genes)的表达［5－7］，临床研究也证实肿瘤低氧与晚期头颈癌症患者的不良预后相关［8］。

有报道鼻咽癌原发瘤及颈部淋巴结转移瘤微环境中都有低氧的表现，并且可能和肿瘤的分化以及肿瘤的体积增加有关［9，10］。治疗前乏氧程度及其在治疗中的变化与肿瘤的消退速度相关［11］。我们的前期研究表明:低氧可以诱导人鼻咽癌CNE－2Z细胞表达VEGF增加［4］，提示低氧可能对鼻咽癌细胞的演进产生影响。为进一步明确低氧对肿瘤细胞的影响，在本研究中，我们建立低氧和复氧处理的体外细胞培养模型，系统地研究低氧和复氧对鼻咽癌细胞生物学特性的影响。

我们的结果表明，低氧虽不利于鼻咽癌细胞生长，表现为细胞的增殖能力受抑制、细胞周期停滞在G1期及侵袭能力降低。然而复氧后细胞快速增殖，在复氧第5 d时A值已经与常氧对照组相比无显著性差异。而且从生长曲线图上可以看出，在复氧2－4 d时，H－R组曲线斜率大于常氧对照组，表明在此期间H－R组的鼻咽癌细胞的增殖速度超过常氧对照组。细胞周期研究显示:复氧后8 h，原来在低氧环境中阻滞于G1期的CNE－2Z细胞顺利通过了细胞周期的G1/S期限制点，同步化进入S期，到复氧24 h后，细胞周期的分布已经基本恢复到常氧对照组水平。此结果提示低氧导致鼻咽癌细胞的G1期阻滞，这可能是肿瘤细胞对不利环境产生的一种适应性变化，使鼻咽癌细胞的存活能力得以在低氧微环境保存;而复氧使鼻咽癌细胞CNE－2Z快速摆脱G1期阻滞，重新进入正常的细胞周期循环。

我们还发现，H－R可能赋于鼻咽癌细胞某些有利于肿瘤恶性演进的生物学特性。细胞黏附实验结果显示:低氧使鼻咽癌细胞同质黏附力降低;复氧后细胞－基质黏附力增加，且随着复氧时间的延长表现出时间依赖模式。Transwell侵袭实验结果显示，复氧处理后，由于低氧而受到抑制的细胞侵袭能力得到恢复，并且较正常对照组有所升高。

侵袭是肿瘤转移的重要环节，在转移的连续性步骤中，肿瘤细胞侵入血管(intravasation)、侵出血管(extravasation)和植入(colonization)目标组织等重要步骤均与肿瘤细胞的侵袭能力相关［12］。低氧后复氧诱导的侵袭能力增加可能促进鼻咽癌细胞的侵袭和转移的过程。细胞黏附也是影响肿瘤侵袭转移的重要环节:瘤细胞与瘤细胞之间的黏附称为同质黏附，同质黏附力降低有利于瘤细胞从原发瘤部位的分离，启动侵袭和转移的过程。另一方面，细胞－基质黏附能力的增加则有利于肿瘤细胞侵入新的组织器官，完成侵袭和转移的过程［3］。因此，我们认为，低氧及复氧通过调节肿瘤细胞的黏附能力，可能促进鼻咽癌细胞侵袭和转移。

综上所述，在低氧和复氧条件下，鼻咽癌细胞经历了一系列生物学特性的变化，这些变化不仅是为了在低氧微环境存活和生长，而且存在着肿瘤细胞对微环境变化的主动性适应过程。提示肿瘤微环境低氧一方面是肿瘤生长的不利因素，另一方面，低氧在肿瘤的发生发展过程中可能起到一种“信号”的作用，促使肿瘤细胞自觉改变一些生物学表型，为进一步的侵袭和转移做准备，甚至主动性启动肿瘤侵袭转移过程。

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