首发精神分裂症患者中ZNF804A rs1344706多态性与非典型抗精神病药疗效间的关联分析*

吴小立，钟智勇，魏钦令，刁飞慈，张晋碚，吴庭娟，熊天威

(中山大学附属第三医院心理科，广东 广州 510630)

精神分裂症患者对抗精神病药物的治疗反应存在着显著的个体差异已是一个不争的临床事实，一系列研究证据表明遗传因素在其中扮演着重要角色[1]。在过去10年间，精神分裂症危险基因的多态性，尤其是5－羟色胺(5－hydroxytryptamine，5－HT)和多巴胺受体2(dopamine receptor 2，D2)基因多态性与抗精神病药物疗效间的关联分析是遗传药理学研究的热点[2－5]。如今，全基因组关联研究(genome－wide association studies，GWAS)已成功筛选出数个精神疾病易感基因[6，7]，然而，这些新发现的易感基因是否与抗精神病药物的靶点有关，并进而影响这些药物的临床疗效仍鲜为人知。

ZNF804A基因的多态性位点rs1344706为第一个全基因组关联分析得到的精神分裂症易感位点[8]，而且，其与精神分裂症间的相关性已经得到一系列研究的证实，包括数个研究对象来自不同人群的全基因组关联研究[9－11]和病例对照研究[12，13]。ZNF804A基因在大脑中广泛表达，其编码的蛋白质为具有一个C2H2结构域的锌指蛋白，然而，其确切的生物学功能尚不清楚。Riley等[12]的研究表明，rs1344706多态性与ZNF804A的转录有关，携带T基因座的精神分裂症患者脑组织内ZNF804A mRNA的转录水平显著高于非携带者。Williams等[14]的研究进一步证明了rs1344706与转录水平有关，Williams根据eQTLs的检测进一步指出:rs1344706多态性与基因转录间的关系与疾病并不相关。尽管目前人们对ZNF804A基因及其多态性rs1344706的功能所知甚少，数个研究利用影像学或神经心理学的方法还是粗略地概括出了与rs1344706相关的表型特征[15－18]。其中，Esslinger等[15]在健康受试者中进行N－back记忆任务测试发现，ZNF804A rs1344706A风险等位基因座T影响着背外侧前额皮层和海马结构之间脑功能的连续性。Walters等[18]研究则发现患者中rs1344706风险等位基因携带者比非携带者具有更好的认知功能表现。最近发表的精神疾病症状学和rs1344706的关联研究报道则表明，精神分裂症患者中T携带者可能具有更多的终生躁狂发作的次数以及终生病情可能更严重[19]。上述研究表明，ZNF804A基因内的rs1344706多态性可能与精神疾病的各种表型相关。鉴于对抗精神病药物的治疗反应属于受遗传因素影响的精神分裂症的表型之一。本研究中，我们假设ZNF804A rs1344706与非典型抗精神病药物的疗效间可能存在关联，选择一群未曾经过药物治疗的首发精神分裂症患者为研究对象，分析非典型抗精神病药物(分别为奥氮平、齐拉西酮和阿立哌唑)治疗4周，PANSS减分率与rs1344706基因型间的关系。

材料和方法

1 材料与仪器

PCR试剂购自宝生物工程有限公司;100bp DNA ladder购自上海威佳生物公司。PCR引物由北京华大生物有限公司合成。主要仪器:Bio－Rad DNA Engine PCR仪;Tanon DNA电泳仪。

2 研究对象

选取2010年2月－2011年2月在中山大学附属第三医院心理科接受治疗的首发精神分裂症住院患者71例，阳性和阴性症状量表(the positive and negative symptom scale，PANSS)≥60分，年龄18－35岁，平均(23.76±6.81)岁，平均病程(0.91±0.35)年，女35例，男36例，均符合:(1)美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSM－Ⅳ)精神分裂症的诊断标准;(2)系首次发作;(3)入组前1月未服用任何抗精神病药物;(4)排除双相情感障碍、器质性精神障碍、精神发育迟滞和痴呆;(5)排除药物及酒精依赖者;(6)排除妊娠哺乳期及卵巢早衰女性患者;(7)排除现患严重和/或慢性躯体疾病者;(8)所有患者均知情同意参加本研究。

3 方法(自然临床观察实验)

3.1 相关量表的评估 选取PANSS对患者予以精神评估，本量表兼顾了精神分裂症的阳性和阴性症状及一般精神病理症状，其各量表重测信度指数为0.77－0.89，较全面地反映了患者的精神病理全貌，属国际通用他评量表。所有患者基线及治疗4周后均经过2名工作10年以上的精神科高年资主治医师予以PANSS各评估1次，2位医师量表评估一致性检验:κ=0.83。

3.2 给药方案 经知情同意后参与研究的患者根据临床需要分别进入奥氮平、阿立哌唑或齐拉西酮治疗组接受单一抗精神病药物治疗4周。奥氮平(商品名再普乐，进口药品注册证号:20020002;选自美国Lily公司，规格是5 mg/片)，阿立哌唑口腔崩解片(商品名博思清，国药准字H20060523)选自中国成都大西南制药公司，规格是5 mg/片)，两药均自5 mg·d－1开始使用，在1周内调至20 mg ·d－1;齐拉西酮(商品名卓乐定，美国辉瑞公司生产，规格是40 mg/片，进口药品注册证号:H20070007)，初始剂量40－80mg·d－1，在1周内剂量调至160－200 mg·d－1，平均(168.28 ±16.49)mg·d－1。出现锥体外系症状者合并使用盐酸苯海索，坐立不安或失眠严重者可合并使用劳拉西泮。

3.3 标本采集及基因组DNA提取 所有研究对象均于清晨8:00空腹状态下采集外周静脉血2 mL，EDTA抗凝。低速离心去血浆，使用包含有150 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L KHCO3和 0.1 mmol/L EDTA的血红细胞裂解液从血样中分离出白细胞，用SDS裂解液+蛋白酶K处理6 h后用苯酚/氯仿抽提蛋白，10000 r/min离心5 min后取上清，应用75%乙醇沉淀基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，提取的DNA放置－80℃保存备用。

3.4 ZNF804A基因rs1344706G/T位点多态性检测应用PCR方法扩增基因组DNA，产生一段包含rs1344706位点，长度为483 bp DNA产物。上游引物GAATCTAGAGTCATGCAGG，下游引物 CAAGTTATTCTCTAGAGTCC。PCR反应条件:95℃预变性4 min，95 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环，72℃ 10 min，40℃保存。PCR扩增产物由北京华大基因研究中心进行直接基因测序。随机选取基因组DNA样本进行PCR并重测序，重复测序和原始测序的一致性为100%。上述操作和分析由专门的生物技术人员进行，结果见图1。

Figure1.The map of PCR from ZNF804A rs 1344706 samples.图1 ZNF804A rs1344706部分样本PCR图

4 统计学处理

(http://ihg2.helmholtz － muenchen.de/cgibin/hw/hwa1.pl)基因型的Hardy－Weinberg平衡应用Software program Finetti检测。3个基因型组间基线的人口学和临床资料应用单因素方差分析(ANOVA)和卡方检验(当最小例数＜5时采用Fisher精确概率法检验分类变量)。以PANSS减分率()来表示治疗反应，应用Pearson's相关系数检验年龄、首发年龄、性别、抗精神病药类型、基线PANSS评分和治疗反应间的关系，选择显著与治疗反应有关的变量作为协变量，应用协方差分析(UNIANOVA)检测基因型与PANSS减分率之间的相关性，组间比较采用LSD检验。所有资料应用SPSS for Windows 16.0统计软件包进行分析，统计水准:P＜0.05。

结 果

1 rs1344706位点基因型检测结果

直接测序基因分型ZNF804A基因rs1344706位点检测到GG、GT、TT基因型，见图2。基因型频率分布均符合Hardy－Weinberg遗传平衡(P＞0.05)，说明资料代表性好。

Figure2.The map of direct sequencing ZNF804A rs1344706 locus polymorphism.1:CC genotype;2:AA genotype;3:AC genotype.图2 ZNF804A rs1344706位点多态性直接测序图

2 一般临床资料和人口学资料

71个首发精神分裂症患者按基因型分为GG(19)、TT(11)和GT(41)3组，不同基因型组别之间，其性别、年龄、首发年龄、PANSS总分、PANSS阳性和阴性因子分、非典型抗精神病药物的类型在基线均无显著差异(P＞0.05)，见表1。

表1 不同基因型组间的一般临床资料和人口学资料Table1.Baseline characteristics of schizophrenia patients with three genotypes of ZNF804A rs1344706 polymorphism

3 ZNF804A基因型与PANSS评分之间的关联分析

3.1 年龄、首发年龄、性别、基线PANSS总分与治疗反应间无显著相关，而抗精神病药物类型与治疗后的PANSS评分改善密切相关。初步方差分析显示:ZNF804A基因rs1344706多态性与PANSS总分及阳性和阴性因子分的改善均显著相关(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05);随后，以抗精神病药物类型作为协变量进行协方差分析发现:ZNF804A基因rs1344706多态性与PANSS总分及阳性因子分的改善仍呈显著相关(均P＜0.05)。当将T携带者与纯合子GG比较时，ZNF804A rs1344706多态性与PANSS总分及阳性因子分改善的关联更显著(均P＜0.01)，见表2。

表2 4周治疗后不同基因型组间的PANSS减分率的比较Table2.Comparison of percentage changes in PANSS score of first－episode patients with different genotypes after 4－week treatment

3.2 与T等位基因携带者(TT+TG)相比，纯合子GG型首发精神分裂症患者的阳性因子分改善更显著，见图3。

Figure3.Association between rs1344706 genotypes and changes in positive PANSS scores.＊＊P ＜0.01 vs GG.图3 rs1344706基因型与PANSS阳性因子分变化之间的关系比较

讨 论

对抗精神病药物的治疗反应被认为是由遗传因素决定的精神分裂症表型之一[1]。过去数十年以来，多数的药理遗传研究聚焦在抗精神病药物的靶目标上，诸如 5 －HT、D2 之类的受体[2，5]。尽管不少研究报道了上述基因多态性与治疗反应间的关系，但精神分裂症患者对抗精神病药物治疗反应差异的诸多原因仍不为人们所知。全基因组关联研究方法的应用成功发现了几个与主要精神疾病有关的基因变异[6]。这些新近发现的基因目前已经成为精神分裂症病因学和精神病理学研究中的关注热点。

本研究发现，首发精神分裂症患者接受非典型抗精神病药物治疗后，ZNF804A rs1344706多态性与其阳性症状的改善密切关联;GG纯合子首发精神分裂症患者的阳性症状对非典型抗精神病药物治疗的反应显著优于T等位基因携带者。这一发现与目前国际上最新的相关研究报道(T等位基因与躁狂的终身发作次数和严重程度相关)相一致[19]。本研究中的3组首发精神分裂症患者(TT、GT、GG)在基线时未发现PANSS评分有显著差异，但是我们的研究对象均是首次发作并接受住院治疗的精神分裂症患者，就此而言他们必定病情偏重且多数患者有显而易见的阳性症状，因此，我们的研究对象不能够完全代表一般的汉族首发精神分裂症患者，而本研究中rs1344706多态性与基线PANSS评分间的关系也不能推论到一般的汉族首发精神分裂症总体。尽管如此，研究对象的严格入组标准还是排除了包括疾病病程和既往治疗史在内的一些重要混杂因素。由于发现非典型抗精神病药物类型也与治疗反应有关，我们在分析中将其列为协变量再次进行了协方差分析，发现虽然关联性有所下降却仍然保持着统计学意义。不过，如要探明各个非典型抗精神病药物疗效与rs1344706多态性间的特异性关联，则需要更大样本量。

本研究是调查ZNF804A基因rs1344706多态性与非典型抗精神病药物治疗反应间关系的第一个临床研究。公认非典型抗精神病药比经典抗精神病药对于5－HT和D2受体的亲和力更高、临床更有效。国外报道rs1344706的风险等位基因关联着ZNF804A转录表达的增加[12]，且这种增加与疾病种类无关，尽管如此，亦不能排除ZNF804A基因与药物疗效相关的可能性。由于5－HT和/或D2受体所触发的信号转导级联效应可能在非典型抗精神病药物的治疗反应中发挥重要作用，推测ZNF804A可能起着转录调节作用，且这一调节作用可能涉及到某个信号通路的下游。进一步阐明ZNF804A是否参与到5－HT和D2受体调节的信号通路中将有助于澄清多态性rs1344706与药物治疗反应差异之间的关联。

综上所述，本研究提示:ZNF804A rs1344706多态性与接受非典型抗精神病药物治疗的首发精神分裂症患者的阳性症状改善程度密切关联，但需要更大样本的研究和其它种族样本的研究进一步支持这一发现。

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