四君子汤对衰老小鼠脑组织caspase-3表达及活性的影响

王怀颖 石少慧 张晶晶 张 悦 史建红 (河北大学基础医学院生化教研室，河北 保定 071000)

细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡过程，在维持机体生理稳态和生长发育中发挥重要作用，同时也参与多种疾病的病理过程。caspase蛋白酶家族在细胞凋亡中发挥重要作用，其中caspase-3是细胞凋亡过程中一个关键分子，是细胞凋亡执行者之一〔1〕。四君子汤是益气健脾的经典方剂，源于宋代《太平惠民和剂局方》。现代药理学研究发现，该方能提高机体抗氧化酶活性，调节代谢、内分泌及免疫功能等〔2〕。本实验拟观察四君子汤对衰老小鼠脑组织caspase-3表达及活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性KM小鼠，购自河北省实验动物中心(合格证号804064)。

1.1.2 药品及试剂 caspase-3一抗购自Santa Cruz公司，SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，caspase-3检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.1.3 四君子汤制备 四君子汤由党参、白术、茯苓、炙甘草按2∶2∶2∶1组成，剪碎、浸泡、水煎，收集滤液，滤渣再次加水煎煮，合并两次滤液，浓缩至2 g/ml，4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 雄性KM小鼠分为青年对照组(3月龄)、老年对照组(12月龄)和四君子汤组(12月龄)，每组10只。四君子汤组每日灌胃四君子汤12 g/kg，其余两组灌胃等量蒸馏水，共8 w。8 w后，断头处死动物，冰台上剥离一侧海马，置4%多聚甲醛溶液固定。剥离另一侧脑组织－70℃冰箱保存，待检测caspase-3活性。

1.2.2 免疫组化法检测海马caspase-3表达 固定的海马组织石蜡包埋，5 μm 切片，脱蜡至水，3%H2O210 min，37 ℃抗原修复10～20 min，血清封闭20 min，滴加caspase-3一抗，4℃过夜。再依次滴加生物素偶联的二抗和辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染，透明，封片，光镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照，阳性信号以胞质出现棕黄色颗粒判断。

1.2.3 免疫组化评分方法 参照文献〔3〕，结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分:a为阳性细胞百分比(无阳性细胞 =0，阳性细胞1% ～10%=1，11% ～50%=2，51% ～80%=3，81% ～100%=4)，b为阳性细胞染色强弱(阴性=0，弱阳性=1，中度阳性=2，强阳性=3)，ab两项乘积为该例组织的免疫组化评分。

1.2.4 脑组织caspase-3活性测定 取一侧脑组织加入适量裂解液制备成组织匀浆。4℃，12 000 r/min离心20 min，取上清液进行测定。具体操作按试剂盒说明书进行。蛋白定量用Bradford法。

2 结果

2.1海马caspase-3表达 caspase-3主要在小鼠海马锥体神经元胞质表达。老年小鼠海马caspase-3阳性细胞明显多于青年对照组(P＜0.05)。与老年对照组比较，四君子汤组小鼠海马caspase-3表达明显下降(P＜0.05)。见表1，图1。

2.2 脑组织caspase-3活性 与青年对照组比较，老年小鼠脑组织caspase-3活性升高，有显著性差异(P＜0.01)。四君子汤组小鼠脑组织caspase-3活性显著低于老年对照组(P＜0.01)。见表2。

表1 不同组别小鼠海马caspase-3表达的变化(n=5)

表2 不同组别小鼠脑组织caspase-3活性的比较(，n=10)

表2 不同组别小鼠脑组织caspase-3活性的比较(，n=10)

1)与青年对照组比较，P＜0.01，2)与老年对照组比较P＜0.01

组别 caspase-3活性(U/mgprot)22.064±4.640老年对照组 39.492±9.9501)四君子汤组 21.170±5.7152)青年对照组

图1 各组小鼠海马caspase-3表达(DAB，×400)

3 讨论

研究表明，进入老龄，心、脑、肝等多种组织器官细胞凋亡过度增加，导致相应组织器官功能下降，进一步加快衰老进程，因此细胞凋亡是衰老发生的一个重要原因〔4，5〕。细胞凋亡的发生最终依赖caspase家族蛋白酶的活化，其中caspase-3是多条细胞凋亡途径的交汇点，是凋亡信号的主要执行者。

Caspase-3以酶原形式存在于胞质中，被激活后，可水解多种胞质、胞核蛋白，破坏细胞骨架蛋白及与DNA损伤修复有关的蛋白质，导致细胞皱缩，DNA裂解，形成凋亡小体〔6〕。Baker等发现，雄性大鼠增龄过程中跖肌 caspase-3，caspase-8，caspase-9表达增多，其活性高低与肌肉减少程度呈正相关〔7〕，说明caspase-3活性高低可反映细胞凋亡速度。本研究显示，增龄过程中，实验动物海马均有caspase-3表达，脑组织可检测出caspase-3活性。老龄小鼠脑组织caspase-3表达及活性均高于青年对照组。

四君子汤是中医学健脾益气的代表方剂，有“轻身延年”之功效，杨靖等发现四君子汤能拮抗自由基损伤，减少D-半乳糖衰老模型小鼠多种组织氧化应激水平〔2〕。自然衰老小鼠补充四君子汤后，可显著抑制海马caspase-3表达，降低脑组织caspase-3活性，减慢细胞凋亡速度。本研究认为，四君子汤可减少或抑制脑组织神经元细胞过度凋亡，达到延缓衰老的目的。

1 Chen XX，Li J，Wu JR，et al.Effects of mild hypothermia on levels of Bcl-2，caspase-3 and apoptotic neurosin hippocampus CA1area after forebrain ischemia in gerbils〔J〕.Chin Pharmacol Bull，2007;23(1):77-81.

2 杨 靖，詹向红，孙 晔，等.四君子汤对D-半乳糖衰老模型小鼠心、肝、脑组织MDA含量及端粒酶活性的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2005;25(6):531-3.

3 Geng YJ，Ishikawa Y，Vatner DE，et al.Apoptosis of cardic myocytes in Gsalpha transgenic mice〔J〕.Circ Res，1999;84(1):34-42.

4 Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors〔J〕.Cancer，2000;89(12):2637-45.

5 裴 媛，李德新，孙松辉.独活及其醇提取物对自然衰老小鼠脑组织细胞凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2005;25(8):959.

6 Granville DJ，Shaw JR，Leong S，et al.Release of cytochrome c，Bax migration，Bid cleavage，and activation of caspase2，3，6，7，8 and 9 during endothelial cell apoptosis〔J〕.Am J Pathol，1999;155(4):1021-5.

7 Baker DJ，Hepple RT.Elevated caspase and AIF gene expression correlatewith progression of sarcopenia during aging in male F344BN rats〔J〕.Exp Gerontol，2006;41(11):1149-56.