H9亚型禽流感病毒TAQMAN探针荧光定量PCR检测方法的建立

邰镝 覃健萍 刘 闯 刘 军,2

（1 广东温氏食品集团有限公司 广东新兴 527400 2 华南农业大学动物科学学院 广州 510642）

禽流感病毒 (avian influenza virus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，根据其致病性强弱，可分为高致病性AIV和温和型AIV[1]。其中H9N2亚型AIV为中低致病力毒株，分布广泛，传播迅速，临床上可引起轻微呼吸道及产蛋下降等症状，同时能造成宿主的免疫抑制而继发感染其他病原微生物，加剧病情。但由于温和型AI在临床症状上同新城疫、传染性喉气管炎和传染性支气管炎等传染病及普通的呼吸道疾病症状极为相似，往往导致误诊或诊断不及时进而造成疫病迅速扩散，严重危害养禽业的发展。为了能及时确诊H9N2亚型禽流感，以便采取相应的防控措施，防止疫情扩散，急需建立一种方便快捷的检测方法，以满足生产的需要。为此，本试验建立了H9N2亚型禽流感Taqman探针荧光定量PCR检测方法(RRT-PCR)，并与传统RT-PCR方法进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 禽流感H9N2亚型病毒A/chicken/Guangdong/LYQ/2011（GenBank:JF715028.1）由华南农业大学动物科学学院保存；新城疫病毒(NDI系)、传染性支气管炎(IB)H120弱毒疫苗由广东大华农动物保健品股份有限公司生产；传染性喉气管炎(ILT)弱毒疫苗由梅里亚动物保健有限公司生产。

1.1.2 仪器与试剂 7500型实时荧光定量PCR扩增仪为美国ABI公司生产；Eppendorf分光光度计（德国）；PCR Super Mix-UDG购自Invitrogen公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；RNA PCR Kit(AMV)试剂盒与PMD19-T载体均由宝生物工程（大连）有限公司提供。

1.1.3 引物和寡核苷酸荧光探针的设计 GenBank数据库中注册的2400个HA基因核苷酸序列，用ClustalX与MEGA 4.0软件进行同源性分析比较，选出高度保守且特异的核苷酸区域，用Primer Express 3.0设计1对特异性引物HA-up与HA-low和1个特异TaqMan探针HA-probe，引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成，探针5'端标记的荧光报告基团为FAM，3'端标记的荧光淬灭基团为TAMRA，具体见表1。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取及反转录 参照RNAzol的使用说明书方法提取病毒RNA作为RT-PCR模板用于反转录试验或置于-80℃保存备用。参照AMV反转录酶使用说明书对RNA进行反转录，反转录引物为Uni12。

1.2.2 RRT-PCR反应体系与优化 RRT-PCR 25μL反应体系为 PCR Super Mix-UDG 12.5ul，ROX 0.05μL，HA-up 0.25μL，HA-low0.25μL，HA-probe 0.15μL，H2O 9.8μL，cDNA 2μL。PCR 反应程序为：50℃ 2min，95℃ 2min，然后 95℃ 3s，60℃30s共45个循环。荧光信号的收集及数据的采集定于60℃。检测结束后，根据噪声情况设定和调整基线及阈值，根据荧光曲线和Ct值初步判断结果。同时用2%的琼脂糖凝胶电泳分析验证荧光PCR扩增产物的特异性和扩增效率。采用矩阵法对引物浓度、探针浓度进行最佳配比筛选，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值(△Rn)。

1.2.3 重组质粒的构建 利用P1与P2引物对病毒HA基因进行扩增，获得390bp产物，使用PMD19-T克隆载体与PCR产物连接，并转化到DH5α株感受态细胞。提取质粒进行PCR鉴定和测序鉴定。测定质粒OD260和OD280，OD260/OD280在1.8～2.0之间可用作标准品。通过OD260值计算质粒浓度并换算成拷贝数/μL。计算公式如下:拷贝数(拷贝/μL)=质粒浓度(g/μL)×阿氏常数/质粒分子量。

1.2.4 标准曲线的建立 分别以10倍稀释的重组质粒为标准品模板，加入探针，按照优化的体系进行RRT-PCR反应，在实时荧光定量PCR仪中检测荧光信号，分别对引物和探针浓度、循环参数、样本用量等进行优化。并利用随机软件进行分析，建立标准曲线。将标准质粒10倍稀释成含有104～108拷贝/μL的5个梯度，按照优化的反应体系进行RRT-PCR，并使用7500 system SDS software进行分析，获得标准曲线。

1.2.5 RRT-PCR的敏感性、特异性和重复性 将EID50为10-9.0的H9N2毒株鸡胚尿囊液10倍系列稀释，对阳性质粒模板进行10倍系列稀释，用常规 PCR（使用国标引物 GB-up与 GB-low）和RRT-PCR检测，比较其敏感性；以NDV、ILTV、IBV病毒核酸和健康鸡组织RNA、水为模板，进行荧光定量PCR，以判断该法的特异性；进行批、批间重复性试验评估RRT-PCR的重复性，批内重复性试验：分别取等量的 3份不同滴度 (104、106、108拷贝/μL)的重组质粒进行荧光定量PCR检测，每份样品作3个重复；批间重复性试验：取以上3份样品，在同一反应条件下进行3次独立的荧光定量PCR检测。

图1 RRT-PCR扩增曲线

2 结果与分析

2.1 反应体系的优化 采用矩阵法对引物浓度、探针浓度进行最佳配比筛选。结果表明，25μL反应体系中 10nmol/mL的引物各 0.25mL，10nmol/mL探针0.15mL，对标准品的检测获得最低的Ct值与最高荧光强度增加值(△Rn)。经各反应条件优选后，每次检测的4个阴性对照均无Ct值，即无扩增曲线；阳性对照出现典型的扩增曲线；在荧光临界值附近，3个重复样品的扩增曲线基本重合。

2.2 RRT-PCR标准曲线的建立 按上述优化的反应条件，以10倍稀释的重组质粒，取5.3×104～5.3×108拷贝/μL浓度的作为标准品模板，分别加入到RRT-PCR反应体系中进行扩增，系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系(图1、2)。生成的标准曲线y轴为循环阈值，x轴为质粒标准品的拷贝数，斜率为-3.582，轴截距为48.298，直线方程为y=-3.582 lgx+48.298，相关系数 R2≥0.999。

2.3 RRT-PCR敏感性试验 将EID50为10-9.0的LYQ鸡胚尿囊液稀释到10-7倍时，常规PCR检测为阴性 (只能测出到10-5，检测引物为国标引物)，而RRT-PCR仍能10-7测出。同时当标准质粒的浓度稀释到5拷贝/μL时仍能出现典型扩增曲线。

图2 RRT-PCR标准曲线

表1 重复性和稳定性试验

从图2可见，在较广的范围内 (5.3×104～5.3×108拷贝/μL)Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现很好的线性关系，相关系数R2≥0.999。将其检测限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5拷贝/L，相当于5个病毒颗粒。从RRT-PCR和常规RT-PCR获得阳性结果的最高稀释度可看出，RRT-PCR的敏感性远高于常规PCR。

2.4 特异性试验 在同一反应条件下AIV阳性样品出现扩增曲线，而NDV、I BV、ILTV、健康鸡组织和水均无Ct值，无扩增曲线。

2.5 稳定性和重复性试验 批内变异系数CV为0.16%～0.65%，批间变异系数为0.50%～0.65%，重复性与稳定性较好，误差小，扩增效率稳定(表1)。由此说明，本试验建立的RRT-PCR检测方法重复性和稳定性较好。

2.6 结果判定 根据临床样品RRT-PCR扩增的Ct值来看，阳性样品的平均Ct值均小于或等于40.00，阴性对照样品在经43次循环后仍无Ct值，说明试验的特异性强。因此，本试验中Ct值小于40.00可认为是阳性，43次循环后仍无Ct值判为阴性，Ct值介于40与43间判定为可疑，需要重复检测。

3 讨论

目前检测AIV比较常用的方法有病毒分离鉴定、电镜、免疫组化、斑点杂交、常规PCR和ELISA等，这些检测方法具有各自突出的优点，但都很难检测微量AIV与准确定量。本试验建立了一种快速且灵敏度高、特异性强及简便的RRT-PCR方法，能够对临床上发生的H9N2亚型病毒进行检测与准确定量[2-3]。所有步骤可在4h内完成，不需要常规PCR的后处理或电泳检测，既简化了操作步骤，快速简便，易于大规模检测，同时克服了常规PCR易产生假阳性、不能定量及操作复杂等问题。在AIV临床样品筛检、流行病学监测及进一步深入研究了解AIV感染的分子机理和免疫调节机理等方面显示良好的应用前景。

[1]甘孟侯主编.禽流感.第二版.北京:中国农业出版社,2002.

[2]Bernd Hoffmann,Martin Beer,Scott M.Reid,Peter Mertens,A review of rRT-PCR technologies used in veterinary virology and disease control:Sensitive and specific diagnosis of five livestock diseases notifiable to the World Organisation for Animal Health Veterinary Microbiology139,2009:1-23.

[3]Spackman,E.,Senne,D.A.,Bulaga,L.L.,Trock,S.,Suarez,D.L.,2003.Development of multiplex real-time RT-PCR as a diagnostic tool for avian influenza.Avian Dis.47,1087-1090.