脑创伤模型创伤区脑组织中miRNA-21的表达变化及意义

(天津医科大学总医院，天津 300052)

近年发现，miRNA 可同时封闭多个靶基因的翻译，干预调节miRNA可改变多个靶基因的表达水平，可大大提高颅脑损伤的干预效率［1］。目前，关于miRNA在脑创伤组织中的表达报道鲜见。在我们的前期研究中，采用miRNA芯片研究脑创伤大鼠模型皮层中miRNA表达变化，得到在脑创伤后14 d内的创伤皮层miRNA动态表达谱［2］。通过生物信息学分析及数据库文献检索，确定miRNA-21可能为脑创伤后修复性基因［3］。2010年1～12月，我们对脑外伤大鼠模型检测其创伤区脑组织中miRNA-21，并分析其与大鼠神经行为学评分和凋亡神经细胞的关系，为脑创伤后神经修复治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年雄性Wistar大鼠196只，体质量250～300 g，随机分为假手术对照组(对照组)和创伤组，各98只。创伤组以液压打击法［4］制作大鼠脑外伤模型;对照组仅行头皮切开和磨除骨窗，保持硬膜完整，不进行打击。头皮切口均消毒缝合。两组分笼喂养，昼夜交替光照12 h，饲养环境温度为(22±2)℃，相对湿度为20%～50%。

1.2 观察指标及方法

1.2.1 大鼠的神经行为学评分 分别在创伤后2、12、24、48、72 h 和 7、14 d，采用神经行为学评分标准［5］，共5项(平衡能力、生理反射检测、提尾反射、运动评估、感觉功能)，0分为正常，1～6分为轻型损伤，7～12分为中型损伤，13～18分为重型损伤。

1.2.2 脑组织中miRNA-21检测及凋亡细胞计数神经行为学评分后分别于上述时点处死大鼠，每次14只。处死后立即断头取脑组织，选取创伤灶边缘水肿区皮层组织，显微镜下清除软膜及血管，生理盐水漂洗，装入冻存管置液氮速冻后转至－80℃冰箱保存待用。其中7只标本采用定量PCR法检测miRNA-21。以U6为内参，设计、合成相应的PCR引物，先取100 ng总miRNA-21加入20 μl逆转录体系，16 ℃ 30 min，37 ℃ 30 min，70 ℃ 10 min，4 ℃保存。取1 μl cDNA 加入20 μl Realtime PCR 体系，扩增反应程序:95℃预变性10 min，95℃ 15 s，60℃30 s，74℃ 3 s，测荧光强度，重复40个循环。75～95℃绘制溶解曲线，确定校准基因后再以同样模板和扩增反应程序通过qRT-PCR扩增目标基因miRNA-21和内标基因RNA［6］。通过统计数据转化成线性形式计算出基因表达相对量2－ΔΔCT值。

另7只标本石蜡包埋、切片，采用TUNEL法进行凋亡神经细胞染色。按试剂盒说明书操作。细胞核呈棕黄色者为凋亡细胞，在20倍目镜和40倍物镜下计数，每一标本计数6张切片，每张切片在创伤灶与正常皮层的交界区计数6个视野，累计计数。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。数据用±s来表示，两组同一时点数据比较采用独立样本t检验;miRNA-21表达水平与神经行为学评分和凋亡神经细胞相关性分析采用Pearson积差相关检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组脑组织中miRNA-21表达水平比较 与对照组比较，创伤组脑组织中miRNA-21表达明显上调，于48 h达峰值，7 d后趋于基线水平;各时点miRNA-21表达量均高于对照组相同时点(P均＜0.05)。详见表1。

表1 两组创伤后各时点脑组织中miRNA-21相对表达量比较(±s)

表1 两组创伤后各时点脑组织中miRNA-21相对表达量比较(±s)

组别miRNA-21 2 h 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d 14 d对照组 1 1.20 ±0.23 1.30 ±0.25 1.30 ±0.65 0.90 ±0.24 1.10 ±0.13 0.90 ±0.12创伤组 12.48 ±0.19 39.84 ±1.78 137.16 ±2.89 229.89 ±1.23 89.10 ±2.33 62.30 ±1.90 60.80 ±3.67

2.2 两组神经行为学评分比较 创伤组大鼠经打击后进入无呼吸的意识丧失状态，15～30 s苏醒，30～40 s恢复呼吸，5 min内恢复正常呼吸频率85.5(66～114)次/min。创伤后 2、12、24、48、72 h和7、14 d，创伤组大鼠神经行为学评分分别为(10.04±1.35)、(10.64 ±1.98)、(10.11 ±2.74)、(8.60 ±1.34)、(6.50 ± 2.99)、(9.65 ± 1.98)、(9.88 ±2.30)分，均高于对照组的0分(P均 ＜0.05)。评分从创伤后24 h升高，至48 h最高，7～14 d基本恢复至基线水平(P均＜0.05)。

2.3 两组脑组织中凋亡神经细胞计数比较 对照组皮层组织可见到少量凋亡神经细胞(1.07±0.78)，创伤组伤后12 h即可见大量凋亡细胞，并逐渐增多，48 h达峰值(P＜0.05)。创伤组创伤后2、12、24、48、72 h 和 7、14 d，凋亡的神经细胞别为(3.36 ± 1.52)、(5.17 ± 1.10)、(13.41 ± 1.92)、(35.43 ± 1.58)、(24.29 ± 2.03)、(17.33 ± 1.47)个/mm2，除伤后2、12 h外，余各时点凋亡神经细胞数均高于对照组(P均＜0.05)。

2.4 创伤组脑组织中miRNA-21表达变化与大鼠神经行为学评分和凋亡神经细胞数量的相关性 创伤组脑组织中miRNA-21表达变化与大鼠神经行为学评分和凋亡神经细胞数变化均呈明显正相关(r=0.430、0.410，P 均 ＜0.01) 。

3 讨论

颅脑创伤过程中的基因表达变化非常复杂，并不是单一信号通路的改变，而是呈现错综复杂的立体网络变化，颅脑创伤瞬间迅速激发了多个基因的表达改变，上游基因表达改变又导致了下游相关基因的表达改变，出现级联瀑布反应和扩大效应。根据我们前期研究所得结果［5］，可以预见在如此复杂庞大的基因表达网络中，仅单独对某个基因实施干预，对脑创伤的治疗影响将是有限的，如能够同时对多基因表达进行干预，将会大大提高治疗有效率。

miRNA由21～23个碱基组成的内源性非编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中。哺乳动物的miRNA与靶标mRNA不是序列严格互补的完全结合，每一哺乳动物的miRNA都能阻止多个下游靶标mRNA的翻译，从而封闭多个基因表达。因此，我们推测从干预单个的基因转向干预miRNA可能会将脑外伤的基因治疗达到事半功倍的效果。但目前鲜有见到miRNA在急性脑损伤病理状态时的研究报道［6］。

有研究［7］发现，miRNA-21在人类多种肿瘤组织中表达上调。我们认为，miRNA-21在肿瘤发生发展中可能起到癌基因的作用，其靶基因很有可能是抑癌基因。有学者认为肿瘤转移抑制基因TIMP3、凋亡相关基因Bcl-2等可能为miRNA-21的靶基因，这为进一步研究miRNA-21在脑创伤作用机制提供了线索。以miRNA-21可能在促进神经细胞增殖和抑制凋亡方面影响脑创伤患者的预后［8］。

本研究结果表明，创伤后创伤区脑组织中miRNA-21表达明显上调，且在伤后48 h达峰值，这与创伤后大鼠神经行为学评分变化一致。说明创伤后大鼠脑组织中miRNA-21表达与其平衡能力、生理反射、提尾反射及运动、感觉功能的恢复程度有一定的相关性，上调miRNA-21在脑创伤后脑组织中的表达，有望改善脑创伤预后。

本研究结果还显示，创伤组凋亡神经细胞数在伤后48～72 h达高峰，而此时点创伤区脑组织中miRNA-21表达明显上调，两者呈正相关关系。基于miRNA-21在胶质瘤中的过表达和miRNA-21抑制细胞程序性凋亡作用的理论基础［9，10］以及本研究结果显示，miRNA-21在创伤急性期和修复早期的创伤脑组织中表达上调。我们推测，miRNA-21与创伤后的神经修复和保护密切相关，我们将在脑创伤模型的基础上给予 miRNA-21干预，以进一步研究miRNA-21与脑创伤预后的关系。

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