新生小鼠视网膜组织中MCP-1的表达变化及意义

(北京世纪坛医院，北京 100038)

单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是趋化因子家族中的主要成员之一，在肿瘤、炎症、糖尿病视网膜病变等新生血管性疾病中，MCP-1起着重要的作用。它与血管内皮生长因子(VEGF)共同参与新生血管的形成［1］，VEGF 可通过激活核因子(NF)-κB、活化蛋白(AP)-1而诱导血管内皮细胞表达MCP-1［2］，而MCP-1可以作用于血管内皮细胞膜上的高亲和受体CCR2，与G蛋白结合，趋化内皮细胞定向运动;同时MCP-1可趋化肿瘤相关巨噬细胞(TAM)进入组织，分泌VEGF等，间接刺激肿瘤新生血管生成。而许多致盲性视网膜疾病都与新生血管的产生有关。2010年6～7月，我们观察了新生小鼠视网膜发育过程中MCP-1的表达，探讨其在血管形成过程中的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6J幼鼠(3、5、7、12、14、21日龄小鼠各10只)60只，雌雄不限，均为无特定病原体级(SPF级)，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2 实验方法 将所有小鼠按日龄(3、5、7、12、14、21日)分别处死。立即摘除眼球，冰上分离视网膜，分别采用RT-PCR和Western blot法、免疫组化染色检测MCP-1 mRNA和蛋白。①RT-PCR检测:取部分视网膜组织，用Trizol试剂提取总RNA，RNA定量后参照文献［3］的方法，用一步法 PCR试剂盒。MCP-1上游引物:5'-CTGGACCCAACTGCAACTGCTT-3'，MCP-1 下游引物:5'-ACTGGCCTTCGGTTTCCTTATC-3'，扩增片段 544 bp;β-actin 上游引物:5'-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3'，β-actin 下游引物:5'-TCCAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG-3'，扩增片段316 bp。合成 cDNA，PCR扩增过程:55℃、30 min，预变性94℃、2 min，变性94 ℃、15 s，退火57 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，后延伸72℃、10 min，共35个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用图像分析仪进行图像分析。所得结果与β-actin的比值为MCP-1 mRNA相对表达量。每样品实验重复3次，取均值。②Western blot检测:取部分视网膜组织，提取总蛋白，参照文献［3］，将定影后的X线胶片用JVCKy-F30B图像摄录输入仪扫描，KONTRONIBAS2.0全自动图像分析系统(德国Koutron公司)进行半定量分析。所得结果与内参照GAPDH的比值为MCP-1蛋白相对表达量。每样品实验重复3次，取其均值。③免疫组化SP染色:取部分视网膜组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，5～7 μm厚切片。采用免疫组化SP法染色。按试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)说明书操作，一抗为单克隆小鼠抗小鼠MCP-1抗体，由美国Santa Cruz公司提供。结果判定标准:细胞质呈棕黄色或黄色为阳性结果。采用Olympus荧光照像显微镜照相，用图像分析软件(Image-Pro Plus，version 4.5 for Windows)分析阳性细胞平均OD值。

2 结果

3日龄小鼠视网膜内核层和节细胞层即有MCP-1蛋白表达(阳性细胞平均OD值为0.083±0.007)，随着视网膜血管的发育，12日龄时MCP-1蛋白阳性细胞明显增多，阳性细胞平均OD值为0.199±0.015(P ＜0.05)，其他日龄时 MCP-1 蛋白阳性细胞数呈基线表达。

不同日龄小鼠视网膜组织中MCP-1 mRNA、蛋白表达结果见图1。MCP-1 mRNA和蛋白在3日龄小鼠视网膜组织中即有表达，12日龄时呈现一过性高表达(P＜0.05)，之后迅速下降，21日龄时表达基本呈基线水平。

图1 不同日龄小鼠视网膜组织中MCP-1 mRNA、蛋白表达

3 讨论

研究表明小鼠等啮齿类哺乳动物的视网膜血管在出生后才开始由视盘发育，同时玻璃体血管退化，12日龄时视网膜浅层血管发育完全，玻璃体血管完全退化［4］，并可以通过眼底镜和荧光血管造影观察其发育过程［5］，因此小鼠成为研究血管形成的理想动物模型。

MCP-1是单核细胞趋化的重要趋化因子，为76个氨基酸残基构成的肽段，可由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等产生，其受体为CCR2，分布在单核细胞、嗜碱性粒细胞和树突状细胞膜上，是一类含7个跨膜区的G蛋白偶联受体超家族(GPCRs)，胞内区与 G蛋白偶联。当 MCP-1与CCR2结合后，受体变构与G蛋白结合，胞内Ca2+内流增加、激活磷脂酶 C以及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)等多种激酶，在其信号传导中发挥作用［6］。

研究表明MCP-1具有趋化单核细胞和T淋巴细胞聚集并激活单核细胞和巨噬细胞的作用，不仅是参与炎症的重要因子，还参与正常血管发育和病理性新生血管形成［2］。小鼠的视网膜血管在出生后开始由视盘发育，同时玻璃体血管开始退化。本研究显示，新生小鼠视网膜组织中MCP-1的表达变化与文献［5］报道的小鼠视网膜发育过程相吻合，在出生后第3天的小鼠视网膜组织中即可检测到MCP-1;生后第7天小鼠玻璃体动脉退化的程度最大，视网膜血管部分发育［5］，生后第7天小鼠视网膜组织中MCP-1表达较第3天时略高;12日龄小鼠视网膜浅层血管发育完全，玻璃体血管完全退化，而此时视网膜组织中MCP-1的表达达到高峰;随着视网膜血管的发育成熟，MCP-1的表达逐渐降低，在14、21日龄呈基线表达。

有研究发现［7，8］，在许多以血管生成为特点的疾病中，MCP-1表达增高。①MCP-1直接作用于血管内皮细胞膜上的CCR2，趋化内皮细胞定向运动，促进血管形成;②MCP-1趋化血管平滑肌细胞和间质细胞向内皮细胞运动，促进TGF-β的分泌，对血管生成起中介作用。本实验发现，在无炎症情况下，MCP-1在小鼠的视网膜血管发育过程中的视网膜组织中均有表达，且表达量与视网膜血管发育的成熟程度和生长速度同步，间接证明了MCP-1与小鼠视网膜发育有关，对视网膜血管的发育起作用。

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