人参皂苷Rg3对乳腺癌细胞增殖的影响及其机制探讨

(1山东省立医院，济南 250021;2山东大学医学院)

目前对乳腺癌的治疗主要采用手术、化放疗等综合治疗。传统化疗药物多存在选择性差、毒性作用大、易发生耐药等问题。研究开发新的化疗辅助药物对于提高疗效，减轻患者痛苦具有重要意义。人参作为我国传统的名贵中药材，具有多种生物活性。已证实多种人参皂苷单体如Rh、Rg等均具有抗肿瘤作用，但其确切机制尚未明了。2010年1月～2011年1月，我们观察了人参皂苷Rg3对雌激素受体(ER)阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的影响。现报告如下并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 人参皂苷Rg3(中国药品生物制品检定所)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(Santa Cruz，USA)，辣根过氧化物酶(HPR)标记二抗(北京中衫金桥生物技术有限公司)，DMEM培养基(GIBCO，USA)，胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)。超敏化学发光(ECL)试剂盒(Amersham Biosciences，USA)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白质定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。

1.2 人参皂苷Rg3溶液制备及细胞培养 人参皂苷Rg3干粉用二甲亚砜(DMSO)溶解为100 mg/ml，备用;MDA-MB-231购自上海细胞所，细胞培养于含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml的DMEM培养基中，37℃恒温培养，生长至80%～90%融合后传代，隔天换液1次。

1.3 细胞分组及细胞活力检测 取对数生长期的MDA-MB-231，按2 000/孔的密度接种于96孔板，培养24 h后加药。每组设4个复孔，分别加入终浓度为50、100、200、400、600 μmol/L 人参皂苷 Rg3(为实验组)，设不加药物的细胞为对照组。采用MTT法测算两组细胞存活率。两组分别于孵育24、48、72 h后每孔加MTT(5 g/L)20 μl，继续孵育4 h后弃培养液，加入DMSO 150 μl/孔混匀，酶标仪(波长570 nm)测定各孔OD值。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4 细胞中Cyclin E及CDC25A检测 收集两组细胞，提取总蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，按试剂盒说明书操作。取蛋白样品40 μg，适量上样缓冲液混匀，100℃变性5 min，用5%积层胶、10%分离胶的SDS-PAGE电泳后，采用Western blot法检测细胞内Cyclin E、CDC25A。用凝胶图像分析系统对Western blot反应阳性条带进行积分光密度(IOD)测定，以Cyclin E、CDC25A IOD值与对应的GAPDH IOD值的比值代表其相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件。计量资料以±s表示，用t检验。P≤0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rg3对MDA-MB-231细胞存活率的影响 50～200 μmol/L的人参皂苷Rg3，具有促进MDA-MB-231增殖作用，促增殖能力与药物浓度成正比(P 均 ＜0.01);400～600 μmol/L的人参皂苷Rg3则抑制细胞增殖，其抑制能力与药物浓度成正比(P均＜0.01)。详见表1。

表1 实验组中不同浓度人参皂苷Rg对MDA-MB-231细胞存活率的影响(%，±s)

表1 实验组中不同浓度人参皂苷Rg对MDA-MB-231细胞存活率的影响(%，±s)

人参皂苷Rg3浓度(μmol/L)MDA-MB-231细胞存活率24 h 48 h 72 h 50 108.65 ±0.92 122.71 ±1.35 141.43 ±1.06 100 115.81 ±1.68 127.45 ±0.71 148.68 ±1.55 200 109.52 ±1.43 123.53 ±1.02 133.68 ±1.84 400 68.13 ±1.76 73.37 ±0.96 80.36 ±1.53 600 57.91 ±2.01 65.25 ±1.78 66.96 ±2.19

2.2 两组细胞中Cyclin E、CDC25A表达水平比较50～200 μmol/L的人参皂苷Rg3，上调MDA-MB-231内Cyclin E、CDC25A表达，并与其药物浓度呈正比(P 均 ＜0.01);400～600 μmol/L的人参皂苷Rg3则抑制Cyclin E、CDC25A表达，其抑制能力与药物浓度成正比(P均＜0.01)。详见表2。

表2 两组MDA-MB-231内Cyclin E、CDC25A相对表达量比较( ±s)

表2 两组MDA-MB-231内Cyclin E、CDC25A相对表达量比较( ±s)

组别Cyclin E CDC25A对照组1.035 ±0.032 0.511 ±0.017实验组50 μmol/L 1.078 ±0.049 0.586 ±0.009 100 μmol/L 1.101 ±0.016 0.595 ±0.014 200 μmol/L 1.113 ±0.027 0.597 ±0.011 400 μmol/L 0.644 ±0.037 0.384 ±0.007 600 μmol/L 0.482 ±0.039 0.353 ±0.013

3 讨论

已有研究证实，人参皂苷类药物可以抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，对化疗药效有增强作用［1］;动物实验也发现人参皂苷可以抑制小鼠体内卵巢癌的生长和癌细胞增殖［2］。人参皂苷Rg3是一种四环三萜皂苷，其抗肿瘤作用已经引起广泛重视，但是确切机制尚未明了。

本研究结果显示，低浓度(≤200 μmol/L)人参皂苷Rg3，对MDA-MB-231增殖具有促进作用，其促增殖能力与药物浓度成正比(P均＜0.01);高浓度(≥400 μmol/L)人参皂苷Rg3则抑制细胞增殖，其抑制能力与药物浓度成正比(P均＜0.01)。对细胞周期相关蛋白的检测发现，与对照细胞比较，低浓度人参皂苷Rg3可上调MDA-MB-231内Cyclin E、CDC25A表达，高浓度人参皂苷Rg3则抑制Cyclin E、CDC25A表达。人参皂苷 Rg3对 MDA-MB-231细胞内Cyclin E、CDC25表达水平的影响与其对细胞存活率的影响趋势一致，提示Rg3可能通过调节细胞周期影响肿瘤细胞的增殖。

Cyclin E主要在细胞G1～S期表达，通过结合并激活细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK)2，形成Cyclin E-CDK2复合物，调节细胞G1、S期的过渡。Cyclin E过量表达可持续性激活CDK2，进而促进视网膜神经胶质瘤蛋白磷酸化，细胞发生异常增殖［3］。目前已经在多种类型肿瘤中发现了 Cyclin E-CDK2的表达异常和功能失调，表现为Cyclin E的表达与细胞周期不同步，且表达水平显著高于生理水平［4～6］。通过药物抑制 Cyclin E的表达，可以造成细胞G1期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖。

CDC25A是双重特异性磷酸酶家族的重要成员，主要在G1中晚期表达，通过催化CDK去磷酸化促使细胞发生 G1、S转换并进入 S期［7］。CDC25A参与G2、M期转换，是重要的细胞周期调控因素之一［8］。CDC25A在结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤均呈过度表达，通过抑制CDC25A的表达抑制肿瘤进展是乳腺癌治疗的一个新方向［9］。

综上所述，高浓度人参皂苷Rg3对人乳腺癌MDA-MB-231的增殖具有抑制作用，此作用与影响细胞周期相关蛋白Cyclin E、CDC25的表达，导致细胞周期停滞于G1或G2期有关。人参皂苷Rg3的抑瘤作用研究还需利用动物模型进行体内实验，其影响细胞周期调控的相关信号通路尚需进一步深入研究。

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