不同烟草青枯病抗性品种的蛋白质组学比较

宋 浩 ，丁 伟 ，沙 伟 ，周 燕 ，陈 薇 *

（1.湖南中烟工业有限责任公司，长沙 410014；2.上海中科新生命生物科技有限公司，上海 200233；3.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞研究所蛋白质组学中心，上海 200233）

烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性灾害。其最显著的症状是枯萎，一旦发病即可造成全株死亡，对烟草的产量和质量影响极大。烟草青枯病广泛分布于全球各地，以热带和亚热带地区的危害最为严重。世界各地每年都有青枯病的发生和流行，造成了巨大的农业经济损失[1]。因此，研究青枯菌致病机理和寻找有效的防治青枯病的方法是当前植物病理学研究的重要课题之一[2]。目前对于烟草青枯病抗性机理的研究，主要集中在基因定位和分子标记辅助育种[3]、基因组学[4-6]和抗性基因的转化[7-9]等方面，而在蛋白质组水平上的研究在国内外还未见正式报道。

蛋白质组学是“后基因组时代”迅速发展起来的技术体系，通过高通量和高分辨率的蛋白分离鉴定技术可以全景式地研究一种生物基因组编码的全部蛋白质[10-13]。蛋白质组学技术在生长发育[14]和各种外界因素作用下的蛋白质结构、功能和丰度的变化[15-18]等热点研究领域已成为一种十分有效且应用广泛的分析手段，该技术有助于在蛋白水平上全面系统认识病原菌侵染后宿主的抗病特点和包括细胞代谢在内的多个生物学过程。本研究以两个不同青枯病抗性烟草品种的叶片为研究材料，采用双向电泳结合质谱分析技术，对不同的青枯病抗性品种的蛋白质表达谱进行比较研究，旨在探讨不同青枯病抗性烟草品种在蛋白质组学水平存在的差异及其对青枯病抗性的影响，为进一步明确烟草的抗青枯病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟草（Nicotiana tabacumL.）品种为抗青枯病品种DB101和易感品种红花大金元。于2010年3月12日进行播种，出苗65 d后取所有叶片，立即在清水中洗净，吸水纸吸干水分，然后用铝箔纸包裹，于-80 ℃冰箱备用。

1.2 试剂

载体两性电解质pH 3～10为GE公司产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、TEMED、溴酚蓝、Tris-base、甘氨酸等为Bio-Rad公司产品；NP-40、碳酸氢铵、三氟乙酸（TFA）、乙腈（CAN）、α-氰基-4-羟肉桂酸（HCCA）等为Fluka公司产品；尿素（超纯）、硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）、过硫酸铵、铁氰化钾、碳酸钾、β-巯基乙醇等为Amresco公司产品；碘乙酰胺、DTT、Triton X-100等为 Sigma公司产品；胰蛋白酶（Trypsin）为Promega公司产品。

1.3 蛋白质提取

称取1.2 g左右叶片，参照Yan等[19]的方法进行叶片全蛋白提取和裂解，按Bradforf法[20]测定裂解后的样品蛋白质浓度，每根胶条的蛋白上样量约为 100 µg。

1.4 双向电泳（2-DE）

二维凝胶电泳参照Casado-Vela等[21]及Yan等[19]的方法进行，参照Yan等[19]的方法进行银染色。

1.5 凝胶图谱分析及差异点的确定

所有凝胶在染完色以后使用 Umax PowerlookⅢ扫描仪进行扫描，用ImageMaster 5.0软件对分析性图谱进行分析。当两者之间的 Ratio值大于 1.2时，认为具有显著性差异。确定差异表达的蛋白质点，并从制备胶上挖取差异点。

1.6 MALDI-TOF/TOF MS 分析及数据库检索

将凝胶上的蛋白质差异点切下后，参照Fernandez等[22]和Gharahdaghi等[23]的方法进行蛋白质胶内消化，萃取出肽段。用2 mL 20%乙腈溶解肽段，取1 µL样品干燥后加人0.5 µL HCCA基质饱和溶液，混合均匀，上样1 µL至点样靶上。室温干燥后，使用美国应用生物系统公司（ABI）ABI 4800 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF进行分析。质谱参数设置如下：反射模式，正离子检测，一级质谱的质量扫描范围为800～4 000 Da。对于每一个样品，选择信噪比最强的8个峰分别作为母离子，然后进行二级质谱分析。获得的一级和二级质谱数据使用GPS Explore V3.6（ABI）软件进行分析，分析后的每一个样品的一级和二级质谱数据，使用 MAsc0T（v2.2）搜库软件对本地数据库进行检索，鉴定蛋白质。检索参数设置如下：数据库为NCBInr；物种为绿色植物；切割的酶为 Trypsin；允许最大的未被酶切位点数为 1；可变修饰为甲硫氨酸氧化；固定修饰为脲甲基化，母离子质量容差为1×10-4Da；片段离子质量容差为0.4 Da。

2 结 果

2.1 DB101和红花大金元烟叶全蛋白的双向电泳图谱

DB101和红花大金元叶片中的双向电泳图谱见图1。pH 3～10的范围内，2个样品经银染后均可得到1 800～2 000个蛋白点，并且可以看出蛋白在等电点和分子量两个方向都得到了较好的分离。

图1 烟草叶片总蛋白的双向电泳图Fig.1 Representative 2-DE gels of tobacco leaf proteins

2.2 差异表达蛋白点的质谱鉴定

定量分析发现共有 26个蛋白点的表达发生显著变化（Ratio≥1.2），相对于易感品种红花大金元，在抗病品种DB101中有12个上调蛋白和14个下调蛋白（图1）。对这26个差异蛋白点用串联质谱的方法（MS/MS）成功鉴定出 22个（二级质谱匹配肽段得分Score超过60并且匹配可信度大于95%）（表1）。根据这22个蛋白所参与的代谢途径和生化功能将它们归纳成以下6个类群：表达调控、过氧化物平衡、光和作用、代谢和能量、防卫相关蛋白和推测蛋白。其中表达调控类有5个蛋白：次黄嘌呤核苷酸环水解酶、核苷二磷酸激酶2、30 S核糖体蛋白、TCP-1型分子伴侣和酪蛋白裂解酶。过氧化物平衡类有3个蛋白：胞质抗坏血酸过氧化物酶、类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶和基质体膜抗坏血酸过氧化物酶。光合作用类有7个蛋白：谷氨酸-1-半醛2、1-氨基变位酶、光合系统 I反应中心亚基 II、羟基丙酮酸还原酶、磷酸酐酶、核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶和2个ATP酶。代谢和能量类有2个蛋白：异柠檬酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶B。防卫相关蛋白有二氨基庚二酸脱羧酶、24Kgermi-like蛋白、乙二醛酶和烟草凝集素。同时还有一个未知蛋白。

表1 差异表达蛋白的MS/MS鉴定结果Table 1 Different regulated expression proteins in DB101 identified by MS/MS

3 讨 论

3.1 表达调控

植物对病原信号的识别是抗性应答的原初反应，一旦抗病信号转导启动以后，就可以通过信号转导途径，可进一步调节基因的表达水平，包括转录水平、转录后水平、翻译水平及翻译后水平的调节。在转录水平上，核酸的加工是一个重要的调节机制。本鉴定结果中得到了一个促进次黄嘌呤核苷酸（IMP）生物合成的关键酶次黄嘌呤核苷酸环水解酶（PurH，点443），其在DB101中上调了1.77倍。IMP做为核苷酸从头合成途径中的重要中间载体[24-25]，说明了转录水平调控过程可能在烟草抗青枯病中得到加强。本研究发现一个在DB101中下调表达的与转录调控相关的蛋白核苷二磷酸激酶 2（NDPK2）。该酶除了催化腺苷三磷酸（ATP）和核苷二磷酸（NDP）之间高能磷酸基团的转移外，还具有 NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性，并参与转录调控和信号转导[26]。翻译活性的变化被认为是最早胁迫反应之一[27]，30 S核糖体蛋白（30 SRP，点1 977）参与到蛋白的翻译和合成，其在抗病品种DB101中表达被抑制。翻译后修饰主要是指蛋白质折叠、加工和降解，完成这一调节功能的主要是分子伴侣类蛋白。TCP-1型分子伴侣（点392）也叫 CCT复合体，主要来自于真核生物的细胞溶质。有研究表明TCP-1型分子伴侣具有重要的亚细胞功能，据估计细胞内 10%蛋白质的折叠与其有关[28]。酪蛋白裂解酶（点173，CIP）广泛存在于生物系统中，其主要功能是促使ATP酶水解ATP提供能量来协助细胞维持胞内蛋白的质量，其在分子伴侣、能量依赖性蛋白酶、DNA复制、蛋白质折叠、抗逆性和适应性以及基因表达调控等多个方面起作用[29]。TCP-1型分子伴侣和CIP在DB101中的上调表达说明翻译后修饰得到加强。

3.2 过氧化物平衡

越来越多的证据表明氧化还原的平衡是连接外界环境胁迫感受和生理调节的一个桥梁[30]。在各种胁迫条件下，很容易产生活性氧（Reactive oxygen species，ROS），一方面它可以作为信号分析诱导植物的抗性反应，但另一方面它能够破化植物的细胞成分。植物在长期的进化过程中形成了一套精细的调控机制来控制活性氧的量。在本鉴定结果中发现了 3个可以调控 ROS的抗坏血酸过氧化物酶（APX）：胞质抗坏血酸过氧化物酶（点1 528）、类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶（点 1 340）和基质体膜抗坏血酸过氧化物酶（点1 326）。APX是植物和藻类特有的清除过氧化氢（H2O2）的重要酶类[31]。抗坏血酸过氧化物酶主要存在2种同工酶：一种是光合器官型，包括位于基质中的APX ( sAPX)和同类囊体膜结合的 APX（tAPX）；另一种是非光合器官型，主要分布于植物细胞的胞浆、线粒体和乙醛酸循环体中[32]。本研究中发现2个光合器官型APX在DB101中均上调表达，另外1个非光合器官型APX下调表达，表明抗病品种DB101可能存在一个独特的通过加强光合器官型抗坏血酸过氧化物酶的活性来控制和协调烟草体内活性氧平衡的机制。但是这些只是根据结果的一个假设，还需要更多的实验加以验证。

3.3 光合作用

本研究共发现了7个与光合作用相关的蛋白：谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶（GAS）、光合系统I反应中心亚基 II（PSI-D）、羟基丙酮酸还原酶（GRHPR）、磷酸酐酶（CA）、核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）和2个ATP酶（点302和1 812）。

GAS在植物的叶绿素等色素物质的合成过程中起着关键性作用[33]，叶绿素的主要功能是不断提供其所吸收的光能来维持植物光和作用的持续运转[34]。PSI-D的主要功能是在光合系统I（PSI）中起到电子传递链的作用，将叶绿体等色素吸收到的光能转化为化学能[35]。本试验中 GAS和 PSI-D在抗病品种DB101中分别上调了4.05倍和2.36倍，表明DB101有可能通过提高GAS和PSI-D的活性来加强对光能的吸收来满足抵御青枯菌侵染的能量需求。由于光合机构中的各个组分是紧密联系在一起的，任一组分的破坏都将影响整个光合作用的效率，另外两个与光合能量代谢相关的酶液泡H+-ATP酶A1亚基亚型和ATP合成酶D链，它们在 DB101中的下调表达说明光合磷酸化产生 ATP过程在抗病过程中可能受到抑制。在本鉴定结果中有2个与卡尔文循环相关的蛋白（RuBisCO和CA）在DB101中均下调表达。RuBisCO在光合作用卡尔文循环里催化第一个主要的碳固定反应，将大气中游离的二氧化碳转化为生物体内储能分子[36]。CA 是另外一个重要的光合作用酶，它通过催化CO2和HCO-3之间的相互转化反应来降低CO2在叶肉细胞中的扩散阻力，为羧化反应提供底物[37]，同时CA能增加RuBisCO的活性[39]。RuBisCO和CA的下调表达表明在 DB101中卡尔文循环可能受到抑制。在卡尔文循环受到抑制的情况下，本鉴定结果中得到了一个与光呼吸紧密相关的蛋白 GRHPR在DB101中上调表达。GRHPR作为光呼吸途径（相关酶）中活性最大的酶[40]，其上调表达将会极大地促进光呼吸。目前光呼吸被普遍认为有利于植物在胁迫条件下维持电子传递，能够有效的阻止光抑制的产生[41]。这些都有可能是 DB101具有抗性的原因。

3.4 代谢和能量

在病菌胁迫条件下，植物细胞内原有的体内平衡被打破。为了建立新的平衡，植物需要启动各种防御措施，如清除氧自由基、加强离子转运等，这些过程均需消耗能量，所以植物会改变体内的初级代谢如碳的能量代谢，使其达到一个新的平衡状态[42]。我们发现在青枯菌侵染之后 DB101中上调了两个与糖酵解途径相关的蛋白：异柠檬酸脱氢酶（IDHs）和谷氨酸脱氢酶 B（GDH）。IDHs可以催化异柠檬酸氧化脱羧形成 α-酮戊二酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。α-酮戊二酸一方面可进入三羧酸循环途径进行有氧呼吸为植物细胞提供能量；同时可为植物细胞对氨的吸收同化提供碳骨架。NADPH则可以维系细胞内的氧化还原平衡，帮助植物抵御氧化胁迫[43]。GDH普遍存在于植物中，有研究表明，GDH在植物的衰老过程及逆境如高温和水分胁迫等状况下行使其铵同化功能，在黑暗或者碳胁迫条件下又能氧化脱铵从而为三羧酸循环提供碳骨架[44]。这两个酶在 DB101中的上调表达可能会促进糖酵解过程，为各种抗病反应提供更多的能量。

3.5 防卫相关蛋白

本研究共鉴定出4个防卫相关的蛋白，1个在DB101中上调的蛋白二氨基庚二酸脱羧酶（DAPDC），3个下调的蛋白24Kgermi-like蛋白、乙二醛酶（GLO）和烟草凝集素（Nictaba）。DAPDC作为 L-赖氨酸合成的关键酶在细菌的相关研究中被大量报道，但在植物中仅有玉米、小麦和烟草等几个物种被提及[45]，本鉴定得到的DAPDC为植物的 L-赖氨酸合成研究提供了一部分数据。同时DAPDC作用的产物L-赖氨酸在植物蛋白质合成代谢中必不可少，而且赖氨酸合成前体 DAP的跨壁结构可以稳定细胞壁的结构并抵抗细胞内的渗透压力[46]。本试验表明，增强表达的DAPDC可能在烟草对青枯菌侵染的防卫响应中扮演着特殊角色。24Kgermi-like蛋白是在多种植物中存在的与Germin具有同源性的一类蛋白。Germin是一种同源五聚体糖蛋白，其可能通过控制细胞壁的伸展性而参与植物的早期发育，同时它们的表达还受病原菌、非生物胁迫及光周期等因素的调控[47]。GLO广泛存在于原核和真核生物中，参与到细胞内分解毒素甲基乙止醛的代谢过程中。因此 GLO催化的化学反应可能参与细胞内的一种解毒机制，同时发现过表达GLO可以提高烟草的抗盐性[48]。Nictaba属于植物凝集素的一种。Nictaba主要分布于烟草叶片薄壁组织细胞中，不仅对病原真菌、细菌和昆虫有一定的抑制作用，在逆境胁迫下还可以通过控制细胞信号转导参与到基因表达调控中[49]。24Kgermi-like蛋白、GLO和Nictaba是3个研究比较透彻的病原防卫相关蛋白，但在本研究中抗病品种 DB101并没有呈现出从无到有或从低到高的诱导表达，而在易感品种红花大金元中的上调表达说明它们可能会增强感病烟草对青枯病的易感性。

4 结 论

本研究表明，抗病烟草品种DB101对烟草青枯病病原菌的侵染存在一个复杂的抗病信号转达和生理调控网络，其作用机制可通过差异表达的蛋白质反馈出来。在抗性品种DB101中上调表达的蛋白质，尤其是胁迫相关的蛋白质，如次黄嘌呤核苷酸环水解酶、二氨基庚二酸脱羧酶、光和器官型抗坏血酸过氧化物酶、异柠檬酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶B等，推测可能与烟草青枯病抗性有关，其中逆境胁迫蛋白及抗氧化胁迫蛋白质可能是烟草抗青枯病病菌侵染的重要因子，在烟草耐受逆境胁迫反应与抗病反应的“交叉对话”中发挥重要作用。而在易感品种红花大金元中，磷酸酐酶、核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶/加氧酶以及 ATP酶等的上调表达则表明光合作用卡尔循环以及电子传递链在青枯菌侵染下的紊乱和降解；24Kgermi-like蛋白等则有可能会增强感病烟草对青枯病的易感性。此外，本研究中尚有 4个未能鉴定到的差异蛋白和一个未知蛋白，可能与烟草对青枯病的抗病性存在一定的相关性。总之，烟草对青枯病抗性机制复杂，其中涉及到众多的信号物质和抗性相关蛋白，随着蛋白质组学等技术的发展和应用，将会有更多的抗性相关基因和蛋白被挖掘，进而大大提高人们对烟草与青枯菌互作机理的认识。

[1]Mole B M,Baltrus D A,Dangl J L,et al.Global virulence regulation networks in phytopathogenic bacteria[J].Trends Microbiol.2007,15(8):363-371.

[2]Kay S,Bonas U.How Xanthomonas type III effectors manipulμlate the host plant[J].Curr Opin Microbiol,2009,12(1):37-43.

[3]Miao L,Shou S,Cai J，et al.Identification of two AFLP markers linked to bacterial wilt resistance in tomato and conversion to SCAR markers[J].Mol Biol Rep,2009,36(3):479-486.

[4]Lykidis A,Pérez-Pantoja D,Ledger T，et al.The complete multipartite genome sequence of Cupriavidus necator JMP134,a versatile pollutant degrader[J].PLoS One,2010,5(3):e9729.

[5]Kawasaki T,Nagata S,Fujiwara A,et al.Genomic characterization of the filamentous integrative bacteriophages {phi}RSS1 and {phi}RSM1,which infect Ralstonia solanacearum[J].J Bacteriol.2007,189(16):5792-5802.

[6]Poueymiro M,Cunnac S,Barberis P,et al.Two type III secretion system effectors from Ralstonia solanacearum GMI1000 determine host-range specificity on tobacco[J].Mol Plant Microbe Interact,2009,22(5):538-550.

[7]Zhang G,Chen M,Li L，et al.Overexpression of the soybean GmERF3 gene,an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt,drought,and diseases in transgenic tobacco[J].J Exp Bot,2009,60(13):3781-3796.

[8]Zhang H,Yang Y,Zhang Z,2008.Expression of the ethylene response factor gene TSRF1 enhances abscisic acid responses during seedling development in tobacco[J].Planta,2008,228(5):777-787.

[9]Zhou J,Zhang H,Yang Y,et al.Abscisic acid regulates TSRF1-mediated resistance to Ralstonia solanacearum by modifying the expression of GCC box-containing genes in tobacco[J].J Exp Bot,2008:645-652.

[10]Agrawal G K,Jwa N S,Rakwal R.Rice proteomics:ending phase I and the beginning of phase II[J].Proteomics.2009,9(4):935-963.

[11]Wasinger V C,Cordwell S J,Cerpa-Poljak A,et al.Progress with gene-product mapping of the Mollicutes:Mycoplasma genitalium[J].Electrophoresis,1995,16(7):1090-1094.

[12]Anderson N G,Matheson A,Anderson N L.Back to the future:the human protein index (HPI) and the agenda for post-proteomic biology[J].Proteomics,2001(1):3-12.

[13]Aranjuelo I,Molero G,Erice G,et al.Plant physiology and proteomics reveals the leaf response to drought in alfalfa (Medicago sativa L.) [J].J Exp Bot,2011,62(1):111-123.

[14]Pang C Y,Wang H,Pang Y,et al.Comparative proteomics indicates that biosynthesis of pectic precursors is important for cotton fiber and Arabidopsis root hair elongation[J].Mol Cell Proteomics,2010,9(9):2019-2033.

[15]Ahsan N,Lee D G,Alam I,et al.Comparative proteomic study of arsenic-induced differentially expressed proteins in rice roots reveals glutathione plays a central role during As stress[J].Proteomics,2008,8(17):3561-3576.

[16]Lee D G,Ahsan N,Lee S H,et al.A proteomic approach in analyzing heat-responsive proteins in rice leaves[J].Proteomics,2007,7(18):3369-3383.

[17]Lee J,Feng J,Campbell K B,et al.Quantitative proteomic analysis of bean plants infected by a virulent and avirulent obligate rust fungus[J].Mol Cell Proteomics,2009,8(1):19-31.

[18]Deng Z,Zhang X,Tang W,et al.A proteomics study of brassinosteroid response in Arabidopsis[J].Mol Cell Proteomics,2007,6(12):2058-2071.

[19]Yan S P,Zhang Q Y,Tang Z C,et al.Comparative proteomic analysis provides new insights into chilling stress responses in rice[J].Mol Cell Proteomics,2006,5(3):484-496.

[20]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

[21]Casado-Vela J,Sellés S,Martínez R B.Proteomic analysis of tobacco mosaic virus-infected tomato (Lycopersicon esculentum M.) fruits and detection of viral coat protein[J].Proteomics,2006,1:S 196-206.

[22]Fernandez J,Gharahdaghi F,Mische S M.Routine identification of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)gels or polyvinyl difluoride membranes using matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) [J].Electrophoresis,1998,19(6):1036-1045.

[23]Gharahdaghi F,Weinberg C R,Meagher D A,et al.Mass spectrometric identification of proteins from silver-stained polyacrylamide gel:a method for the removal of silver ions to enhance sensitivity[J].Electrophoresis,1999,20(3):601-605.

[24]Mäntsälä P,Zalkin H.Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA and guaA,involved in the conversion of IMP to AMP and GMP[J].J Bacteriol,1992,174(6):1883-1890.

[25]Nishiyama M,Hoshino A,Tsai L,et al.Cyclic AMP/GMP-dependent modulation of Ca2+ channels sets the polarity of nerve growth-cone turning[J].Nature,2003 ,423(6943):990-995.

[26]Choi G,Yi H,Lee J,et al.Phytochrome signalling is mediated through nucleoside diphosphate kinase 2[J].Nature,1999,401(6753):610-613.

[27]Gallie D R.Posttranscriptional Regulation of Gene Expression in Plants[J].Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,1993,44:77-105.

[28]Thulasiraman V,Yang C F，Frydman J.In vivo newly translated polypeptides are sequestered in a protected folding environment[J].EMBO J,1999,18:85-95.

[29]Haslberger T,Bukau B,Mogk A.Towards a unifying mechanism for ClpB/Hsp104-mediated protein disaggregation and prion propagation[J].Biochem Cell Biol,2010,88(1):63-75.

[30]Foyer C H,Noctor G.Redox homeostasis and antioxidant signaling:a metabolic interface between stress perception and physiological responses[J].Plant Cell,2005,17(7):1866-1875.

[31]Simonetti E,Alba E,Montes M J,et al.Analysis of ascorbate peroxidase genes expressed in resistant and susceptible wheat lines infected by the cereal cyst nematode,Heterodera avenae[J].Plant Cell Rep,2010 ,29(10):1169-1178.

[32]Najami N,Janda T,Barriah W,et al.Ascorbate peroxidase gene family in tomato:its identification and characterization[J].Mol Genet Genomics,2008,279(2):171-182.

[33]Kannangara C G,Gough S P,Bruyant P,et al.tRNA(Glu)as a cofactor in delta-aminolevulinate biosynthesis:steps that regulate chlorophyll synthesis[J].Trends Biochem Sci,1988,13(4):139-143.

[34]Toledo-Ortiz G,Huq E,Rodríguez-Concepción M.Direct regulation of phytoene synthase gene expression and carotenoid biosynthesis by phytochrome-interacting factors[J].Proc Natl Acad Sci,2010,107(25):11626-11631.

[35]Ohashi S,Iemura T,Okada N,et al.An overview on chlorophylls and quinones in the photosystem I-type reaction centers[J].Photosynth Res,2010,104(2-3):305-319.

[36]Bar-Even A,Noor E,Lewis N E,et al.Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(19):8889-8894.

[37]Evans J R,Kaldenhoff R,Genty B,et al.Resistances along the CO2 diffusion pathway inside leaves[J].J Exp Bot,2009,60(8):2235-2248.

[38]Cousins A B,Baroli I,Badger M R,et al.The role of phosphoenolpyruvate carboxylase during C4 photosynthetic isotope exchange and stomatal conductance[J].Plant Physiol,2007,145(3):1006-1017.

[39]Fukao Y,Hayashi M,Nishimura M.Proteomic analysis of leaf peroxisomal proteins in greening cotyledons of Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell Physiol,2002 ,43(7):689-696.

[40]Kozaki A,Takeba G.Photorespiration protects C3 plants from photooxidation[J].Nature,1996,384:557-560.

[41]Yan S,Tang Z,Su W,et al.Proteomic analysis of salt stress-responsive proteins in rice root[J].Proteomics,2005,5(1):235-244.

[42]Foreman J,Demidchik V,Bothwell J H,et al.Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth[J].Nature,2003,422(6930):442-446.

[43]Robinson S A,Slade A P,Fox G G,et al.The role of glutamate dehydrogenase in plant nitrogen metabolism[J].Plant Physiol,1991,95(2):509-516.

[44]Hudson A O,Bless C,Macedo P,et al.Biosynthesis of lysine in plants:evidence for a variant of the known bacterial pathways[J].Biochim Biophys Acta,2005,1721(1-3):27-36.

[45]Azevedo R A,Arruda P,Turner W L,et al.The biosynthesis and metabolism of the aspartate derived amino acids in higher plants[J].Phytochemistry,1997,46(3):395-419.

[46]Hudson A O,Singh B K,Leustek T,et al.An LL-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants[J].Plant Physiol,200,140(1):292-301.

[47]Vallelian-Bindschedler L,Mösinger E,Métraux J P,et al.Structure,expression and localization of a germin-like protein in barley (Hordeum vulgare L.) that is insolubilized in stressed leaves[J].Plant Mol Biol,1998,37(2):297-308.

[48]Singla-Pareek S L,Reddy M K,Sopory S K.Genetic engineering of the glyoxalase pathway in tobacco leads to enhanced salinity tolerance[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(25):14672-14677.

[49]Van Damme E J,Barre A,Rougé P,et al.Cytoplasmic/nuclear plant lectins:a new story[J].Trends Plant Sci,2004,9(10):484-489.