一种利用水提物快速简便检测烟草中TMV的方法

杨金广，张 帅，申莉莉，钱玉梅，李 晓，王凤龙*，段燕平，林北森，王 永，曹 娜

（1.烟草行业病虫害监测与综合治理重点实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.云南省烟草公司保山市公司，云南 保山 678000；3.广西壮族自治区烟草公司百色市公司，广西 百色 533000；4.山东中烟工业有限责任公司，济南 250100）

作为烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的代表种，烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）是一种分布广泛的植物病毒，可侵染烟草和番茄以及其他茄科植物等300多种植物，具有广泛的寄主范围，为正单链RNA（+ssRNA）病毒。其基因组由6 395 nt组成[1]，至少编码 4 个蛋白[2-4]，126 kDa 和183 kDa两个蛋白编码病毒的复制酶基因，是病毒复制所必需的，30 kDa的运动蛋白（movement protein,MP）控制着病毒胞间运动。17 kDa的外壳蛋白（coat protein,CP）是病毒的包装衣壳，对病毒在寄主维管束组织的长距离运输具有重要的作用。基因组 5′ 端和 3′ 端非编码区（untranslated regions,UTRs）具有调控RNA复制和转录的功能，并对RNA的稳定也至关重要，具有RNA复制和合成起始的识别位点[4-7]。

TMV作为最早研究的病毒，其检测体系已比较完善。常见的有电镜检测、血清学检测和分子检测（RT-PCR、real-time RT-PCR、PCR-ELISA 和Western-bloting），这些方法虽然对 TMV检测具有高度的特异性和灵敏性，但均需要专门昂贵的设备仪器和试剂，并且耗时较长，例如血清学检测一般需要12 h以上，而RT-PCR也需要6 h左右。本研究对感染TMV的烟草叶片的水提物进行了检测，能够稳定的检测到与TMV相关的特异性条带，为检测烟草中的TMV侵染提供了更快捷、经济的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

2008年采自中国农业科学院烟草研究所青岛市即墨试验基地呈典型烟草花叶病症状的烟草叶片，经枯三生烟草单斑分离后，保存在云烟 85植株上，经RT-PCR检测确定为TMV，防虫条件下，置于温室中，在14 h光照和10 h黑暗的光周期下进行保存培养。

1.2 研究方法

1.2.1 烟草叶片水提物提取与检测 取0.1 g新鲜的烟草叶片，置于100 μL无菌水中，研磨成匀浆，12 000 rpm，离心5 min，取上清液20 μL于1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，溴化乙锭染色后置于紫外凝胶成像系统（Pharmacia Biotech,Imagemaster VDS）采集图像。

1.2.2 总RNA提取 取烟草TMV病叶0.05 g，于液氮中研磨成粉末状，加入1 mL TRIzol reagent充分研磨，室温放置5 min；加入氯仿200 μL，充分震荡15 s，室温放置5 min；12 000 rpm，4 ℃下离心 15 min；将上层水相转入另一离心管中，加入0.5 mL异丙醇；12 000 rpm，4 ℃离心10 min（可见RNA沉淀），弃去上清；加入1 mL 70%乙醇（涡漩，7 000 rpm离心5 min）；干燥RNA沉淀，加ddH2O 20 μL溶解即可。

1.2.3 RT-PCR检测 取提取后的总RNA 3 μL，利用M-MLVEasyscriptReverse Transcriptase试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，北京）进行cDNA合成，具体方法均按照说明书进行操作。取 1 μL cDNA产物，利用用于PCR检测反应，反应体系由10 μL 5×PCR buffer，2 μL dNTP mixture (2.5 mM)，正反向引物各 2 μL（10 μM）（CPF：5′-ATTAGACCCGCTAGTCACAGCAC-3′；CPR：5′-GTGGGGTTCGCCTGATTTT-3′）和 10 μL ddH2O组成，反应在50 μL的体积中进行反应。反应条件如下：第一步95 ℃，4 min；第二步95 ℃，15 s，62 ℃，35 s，共进行40个循环。PCR结束后，取 8 μL反应液在 1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，溴化乙锭染色后置于紫外凝胶成像系统（Pharmacia Biotech,Imagemaster VDS）采集图像。

1.2.4 Northern-blotting分析 以TMV复制酶基因(accession number:AF395127; TMV-F:5′-GTTTCAGGATTCCCGTAC-3′; TMV-R:5′-ATCAGAAATATCGCCAGT-3′;)为靶基因，利用地高辛标记的 dUTP (DIG DNA Labeling and Detection Kit,Roche Applied Science)通过 RT-PCR合成一段600 bp的DNA探针。新鲜提取的TMV病叶水提物40 μL上样于10%甲醛变性琼脂糖凝胶进行电泳，然后通过电转于硝酸纤维素膜上；然后65 ℃条件下，与探针反应16 h；2 × SSC和0.1%SDS于50 ℃条件下，洗涤2次，每次15 min；0.5× SSC和0.1% SDS于65 ℃条件下，洗涤2次，每次20 min；最后根据显色试剂盒操作说明进行显色反应（Roche Biochemicals）。

2 结 果

提取后的水提物经过 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现在TMV阳性植株中能够稳定地检测到6 000 bp左右的条带，而在健康烟草叶片水提物中检测不到任何电泳条带（图1）。为了进一步验证结果的准确性与特异性，利用TMV特异性引物，对相同材料进行了RT-PCR检测验证，结果表明，在TMV阳性植株中能够检测到83 bp的片段，大小与预期相符（结果未显示），而在健康烟草中，检测不到任何条带，说明该方法具有较高的特异性。为了进一步揭示水提物中的特异性电泳条带，以TMV 复制酶基因为探针，通过Northern-blotting分析，结果显示，水提物中电泳条带与探针具有较强的杂交信号，而在健康烟株、PVY病株和CMV病株3种水提物中均检测不到任何杂交信号（图2），暗示该电泳条带可能为TMV的基因组RNA。值得注意的是在该检测体系中，水提物在常温下非常不稳定，需要提取完毕后，立刻进行电泳检测，在室温条件下静置 2 h，检测的电泳条带就变得非常微弱（图1），而静置3 h以上，就很难再检测到任何电泳条带（图1）。

图1 TMV烟草叶片水提物检测结果Fig.1 The aqueous extract detection of tobacco leaves infected by TMV

图2 不同烟草材料水提物的Northern-blotting分析Fig.2 Northern blot analysis of aqueous extract from TMV tobacco plant

3 讨 论

在TMV烟草病叶中能够检测的6 000 bp左右的电泳条带，推测该条带可能为TMV基因组产物，因为TMV基因组大小为6 395 nt组成。同时，室温条件下，水提物的不稳定性也暗示该条带可能为RNA，因为 TMV为+ssRNA，RNA在没有经过DEPC处理的环境中，及RNase存在的条件下，极易被RNase降解，而TMV也是+ssRNA病毒。因此，综合两方面推测在TMV病叶水提物中检测到6 000 bp的电泳条带可能为TMV基因组RNA。

李凡等曾利用水作为提取液来检测烟草丛顶病毒，能够检测到与病害特异性 900 bp小分子RNA，但是单纯的水提物稳定性差，重复性不好，为此研究者对方法进行了修改，对水提物重新进行了异丙醇或NaAC进行沉淀，然后利用75%的乙醇对沉淀进行洗涤，发现检测结果非常稳定和特异。但在本研究中，利用李凡等的异丙醇和NaAC沉淀法，检测结果并不理想，推测李凡等检测的900 bp的小分子RNA可能为双链RNA（dsRNA）[8]。而在本研究中检测到 6 000 bp左右的条带可能为+ssRNA，dsRNA较+ssRNA在常温下更稳定。

同时该检测方法还具有方便快速的特点，在常规检测中耗时均较长，例如生物学检测需要5～10 d才能检测出来，并且易受周围环境和寄主的影响，ELISA需要12 h左右，RT-PCR则需要3 h以上。而该方法只需15 min即可检测到TMV的存在。同时较ELISA和RT-PCR更加经济，不需要昂贵的仪器，仅需要一个电泳槽和紫外观察装置。

作为一种快速检测的方法，也具有一定的局限性，就是在检测过程中需要电泳装置，这在实际生产中是很难进行推广应用的。因此，生产中非常需要研究和开发更加方便快捷的检测方法与工具，当前，在其他研究材料中常用的试纸条快速检测是值得推荐的一种方法。

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[8]李凡，程建勇，吴建宇，等.一种改进的烟草丛顶病快速诊断方法[J].植物检疫，2005，19（5）：278-280.