AMPK激活剂抑制PDGF诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的机制研究*

吴 峻，郑 婷，童珊珊，李钰青，佘晓芬，张 萌，肖 云

(广州医学院第一附属医院心内科，广东 广州 510120)

研究表明，各种损伤因子(如血压、血脂等)可促使血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)分化、增殖并迁移形成新的内膜，这种增殖效应在动脉硬化、血管成形术后再狭窄发生机制中起着重要作用［1］。血小板源性生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)是影响血管内皮的常见炎症因子之一，它有不同的单聚体或多聚体(如PDGF－AA、－BB、－CC等)，可通过不同的受体对不同组织产生不同的效应。PDGF在动脉粥样硬化发生机制中的作用除了损伤血管内皮外，也可能通过促进VSMCs增殖来实现，其详尽机制仍在探索中［2，3］。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶 (AMP－activated protein kinase，AMPK)是细胞能量代谢的调节因子，还可能参与细胞基因的转录调控，并导致细胞在分裂增殖周期中停滞，从而抑制细胞的增殖［4］。目前有关PDGF和AMPK影响VSMCs的详尽机制尚未明了，本实验通过应用AMPK激活剂5－氨基咪唑－4－甲酰胺核糖核苷(5－aminoimidazole－4 －carboxamide－1－β－D－riboside，AICAR)及 PDGF干预VSMCs，初步观察其作用下VSMCs的增殖变化;并通过检测AMPK活性对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)表达强度的影响，探讨AMPK活化影响VSMCs增殖的可能途径。

材料和方法

1 试剂

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone);DMEM培养基、1×青霉素－链霉素、胰蛋白酶(Gibco);二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(Sigma);血小板衍生生长因子－BB(platelet－derived growth factor－BB，PDGF－BB)(Peprotech);AICAR(TRC);p－AMPK抗体(CST);p－mTOR抗体(Bioworld);αactin平滑肌细胞检测试剂盒(博士德公司);精准定量DNA marker(Trans);RT－PCR试剂盒(TaKaRa);全蛋白提取试剂盒(凯基公司)。仪器:低温冷冻离心机(Hettich)，SM－F123制冰机(Sanyo)，恒压恒流电泳仪DYY－III2(北京六一设备厂)，低温冰箱(Forma Scientific)，VCX750型超声波细胞粉碎机(Sonic)，核酸定量仪(Eppendorf)，PCR扩增仪(Biometra)，Sunrise酶标仪(Tecan)，电泳及转膜装置(Bio－Rad)，凝胶成像及图像分析系统分析(中国上海天能)。

2 VSMCs的培养

雄性SD大鼠购自广东实验动物中心(粤监证字2008A002)，体重200－300 g，戊巴比妥麻醉后引臼处死，无菌状态取出胸主动脉，采用组织块贴壁培养法培养，传代筛选后用α－actin平滑肌细胞检测试剂盒鉴定细胞，所有实验均采用4～6代细胞。

3 细胞增殖检测(MTT法)

取第4代VSMCs以2.5×104接种到96孔板贴壁24 h，饥饿24 h后更换10%胎牛血清的DMEM培养基并加入0.5 mmol/L AICAR，PDGF－BB干预浓度为 10 μg/L，分为:A 组(AICAR)、P 组(PDGF)、A+P组(AICAR+PDGF)和对照组4个组，每组6个复孔，每作用24 h、48 h及72 h前30 min加入MTT 试剂(5 g/L，20 μL)，终点时间加入 200 μL DMSO溶解颗粒，酶标仪在570 nm处记录数值，每组5个复孔，实验重复5次。

4 蛋白活性检测(Western blotting)

4.1 p－AMPK表达检测 取第4代VSMCs以4×104接种到50 mm细胞培养皿贴壁24 h，饥饿24 h后更换10%胎牛血清的DMEM培养基并加入AICAR 其终浓度0.5 mmol/L。分别在30 min、1 h、3 h、6 h、12h采用凯基全蛋白提取试剂盒，抽提细胞总蛋白，取20 μg以4% ～12%的十二烷基硫酸钠－聚丙酰胺凝胶(SDS－PAGE，Invitrogen)电泳分离，转膜后，5%BSA的TBST封闭过夜，Ⅰ抗4℃孵育2 h，Ⅱ抗室温1 h，ECL试剂盒显带分析并测灰度值，实验重复3次;另取第4代VSMCs以4×104接种到50 mm细胞培养皿贴壁24 h，饥饿24 h后更换10%胎牛血清的DMEM培养基并按不同组加入AICAR浓度0.5 mmol/L，PDGF －BB 浓度10 μg/L，分为:A 组(AICAR)、P组(PDGF)、A+P 组(AICAR+PDGF)和对照组4个组，每组6个复孔，在12 h采用凯基全蛋白提取试剂盒抽提细胞总蛋白，按上述同法处理后检测各组灰度值，实验重复3次。

4.2 p－mTOR表达检测 取第4代VSMCs以4×104种到50 mm细胞培养皿贴壁24 h，饥饿24 h后更换10%胎牛血清的DMEM培养基并加入AICAR其终浓度 0.5 mmol/L。分别在 30 min、1 h、2h、6 h、12 h抽提细胞总蛋白，取20 μg以4% ～12%的SDS－PAGE电泳，进行分析并测灰度值，实验重复3次;另取第4代VSMCs以4×104接种到50 mm细胞培养皿贴壁24 h，饥饿24 h后更换10%胎牛血清的DMEM培养基并按不同组加入AICAR浓度0.5 mmol/L，PDGF －BB 浓度 10 μg/L，分为:A 组(AICAR)、P 组(PDGF)、A+P组(AICAR+PDGF)和对照组4个组，每组6个复孔，12 h采用凯基全蛋白提取试剂盒抽提细胞总蛋白，按上述同法处理后检测各组灰度值，实验重复3次。

5 统计学处理

结 果

1 VSMCs的培养及鉴定

光镜下可见，传代培养的第4代细胞呈长梭形，及典型的“峰－谷”样生长，经免疫组化染色后，可见胞浆内阳性着色的丝状 α－actin分布，确认为VSMCs，见图 1、2。

Figure 1.The growth of VSMCs(×200)VSMCs at the 4th passage showed peak－valley－like growth.图1 平滑肌细胞生长情况

Figure 2.Confirmation of VSMCs(×400).Positive－stained filamentous α － actin in the cytoplasm was obsered.图2 平滑肌细胞染色确认

2 PDGF及AICAR在不同时点对VSMCs增殖的影响

PDGF 干预24 h、48 h、72 h 后，明显促进 VSMCs的MTT值升高(P＜0.05);AICAR在不同时点均可以使VSMCs的MTT值显著下降(P＜0.05)，见表1。

表1 PDGF及AICAR作用不同时间对细胞MTT值的影响Table 1.Effects of PDGF and AICAR on MTT value at different time points(.n=5)

表1 PDGF及AICAR作用不同时间对细胞MTT值的影响Table 1.Effects of PDGF and AICAR on MTT value at different time points(.n=5)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs group P.P:PDGF;A:AICAR;A+P:AICAR+PDGF.

Group 24 h 48 h 72 h Control 0.136 ±0.012 0.188 ±0.016 0.261 ±0.0210.164 ±0.011* 0.253 ±0.011* 0.312 ±0.025*A 0.121 ±0.011* 0.149 ±0.011* 0.188 ±0.017*A+P 0.119 ±0.011*# 0.165 ±0.011*# 0.229 ±0.019*#P

3 AICAR对细胞AMPK的激活作用

AICAR干预细胞，分别在不同时点检测到p－AMPK的表达，经灰度分析显示AMPK的激活随药物干预时间增加而逐渐增强，见图3。

Figure 3.Expression of p－AMPK at different time points(Western blotting)..n=3.*P＜0.05 vs control.图3 不同时点p－AMPK的表达

4 PDGF、AICAR及两者联合作用对细胞 p－AMPK的影响

各组干预细胞12 h后分别检测p－AMPK的表达。与对照组比较，P组灰度值降低、A+P及A组均升高，A+P组高于P组，见图4。

5 AICAR对磷酸化mTOR(p－mTOR)蛋白表达的影响

对照组细胞可见p－mTOR强表达，AICAR干预后p－mTOR表达活性减弱，随着药物干预时间延长，p－mTOR表达减弱更加明显，见图5。

Figure 4.Expression of p－AMPK at different groups(Western blotting)..n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs group P.P:PDGF;A:AICAR;A+P:AICAR+PDGF.图4 p－AMPK在不同干预组的表达

Figure 5.Expression of p－mTOR in different time points(Western blotting)..n=3.*P＜0.05 vs control.图5 p－mTOR蛋白在不同时点的表达

6 PDGF、AICAR及两者联合作用对磷酸化mTOR的影响

各组干预细胞12 h后分别检测p－mTOR的 表达。与对照组比较，P组灰度值增高、A+P及A组均降低，A+P组低于P组，见图6。

Figure 6.Expression of p－mTOR in different groups(Western blotting)..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs group P.P:PDGF;A:AICAR;A+P:AICAR+PDGF.图6 p－mTOR蛋白在不同干预组的表达

讨 论

在动脉粥样硬化的发生、发展过程中，以及冠状动脉介入治疗后都会出现血管增殖性改变，严重威胁着治疗的进展和疾病的预后，在这一环节中，血管中层平滑肌细胞是否进入周期性的增殖状态起着关键的作用。在正常血管壁完整的情况下，血管壁中层平滑肌细胞处于G0期的稳定状态，只有在一些刺激因素的作用下(如球囊损伤、PDGF的刺激)，才会触发其增殖［5］。血管平滑肌细胞的异常增殖成为冠心病急性事件的独立危险因素，探讨其增殖及抑制途径对于防治急性冠脉事件的发生具有重要意义。

AMPK是一个苏氨酸激酶，被认为是所有真核细胞的能量感受器，激活的AMPK对肿瘤细胞的生长有强烈抑制作用，其效应主要通过抑制细胞周期、胞内蛋白质合成以及体内脂肪酸和胆固醇的合成过程来实现。本研究显示，AMPK的激活对血管平滑肌细胞的增殖亦起着显著的抑制作用(P＜0.05)。

AICAR是被广泛认可的AMPK激活剂，可能是今后治疗缺血性心脏病很有潜力的药物［6］，AICAR通过腺苷载体转运到细胞内，在腺苷激酶的作用下被磷酸化形成5’－AMP类似物(zeatin riboside－5’－monophosphate，ZMP)，ZMP 具有 AMP 的类似结构，它可以与γ亚基上的CBS序列结合，引起AMPK的构象改变，同时保护抑制Thr172位点的去磷酸化，在磷酸化的作用下，使AMPK激活［7］。研究发现，在大鼠股动脉的导丝损伤模型中，如果给予AICAR使AMPK能够持续的激活，血管损伤处新内膜的形成可受到明显抑制，内皮下平滑肌细胞的增殖也被明显抑制［8］。本实验结果显示，在AICAR作用下p－AMPK的表达强度随时间变化而逐渐增强，在12 h时达到最高值;PDGF干预后分别检测p－AMPK，PDGF能抑制对照组AMPK的表达，但AICAR激活作用下PDGF抑制AMPK表达的效应明显减弱，同时，检测 MTT值提示:AMPK的激活还可能抑制PDGF诱导的VSMCs增殖效应(P＜0.05)。其机制尚未明了，可能与促进p53的表达上调和磷酸化，使血管平滑肌细胞增殖周期停滞在G1/S阶段有关，其抑制增殖的效应主要是通过抑制MAP激酶信号系统实现的［9］。

实验结果显示，AMPK激活后，p－mTOR的表达受到明显抑制，在AMPK激活12 h后，其表达几乎受到完全抑制，已知PDGF能诱导VSMCs增殖效应，PDGF干预后检测p－mTOR的 表达明显增强，但AICAR加PDGF联合干预后p－mTOR的 表达低于PDGF单独诱导组，即PDGF对mTOR活性的上调效应被AICAR抑制，进一步提示AMPK激活后的抑制增殖效应可能还与mTOR活性的下调有关，这中间可能同样存在AMPK/mTOR信号途径影响VSMCs的增殖。mTOR是细胞内多种重要信号转导通路的枢纽，调控翻译起始、转录、蛋白合成和降解功能，进而调节细胞的生存、增殖和凋亡等细胞重要生理功能，LKB1/AMPK/mTOR信号通路是其中较经典的信号通路之一，当细胞内AMP/ATP比值增高时，AMP与AMPK亚单位结合引起构象的改变，然后LKB1与AMPK的α亚单位结合引起AMPK磷酸化而激活［10］，激活的AMPK通过使结节性硬化复合体2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)磷酸化来阻断mTOR的活化［11］。AMPK对 VSMCs的增殖抑制机制可能与mTOR下游的2个重要靶蛋白有关，即核糖体p70S6激酶(S6K1)和4E－BP1，两者均参与蛋白翻译的关键环节［12］。

综上所述，实验结果显示PDGF对VSMCs有促增殖效应，AICAR干预后可激活AMPK，并显著抑制PDGF诱导的VSMCs增殖，细胞mTOR活性的下调可能参与了VSMCs的抑增殖效应。

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