英夫利昔单抗对兔骨关节炎动物模型的影响

吕洪华 张乾坤 吴雪莲

(丽水市中心医院,浙江 丽水 323000)

关节软骨的丢失和破坏是骨关节炎(OA)的主要特征,越来越多的证据表明OA不仅仅是一种退变性关节炎,大量的炎症因子如白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等参与了软骨破坏的过程[1-2]。英夫利昔单抗(infLiximab)是一种可溶性抗TNF-α抗体,目前被广泛用于治疗类风湿关节炎(RA)。本研究中作者将评价英夫利昔单抗是否对兔OA动物模型有软骨保护作用。

1 材料与方法

1.1 兔OA动物模型的建立 新西兰大白兔共30只,体质量2.1～3.0Kg,由温州医学院实验动物中心提供。10%水合氯醛(4mL/Kg)耳缘静脉麻醉后,参照Hulth法[3]建立兔OA动物模型,单笼饲养,鼓励动物活动。

1.2 分组与给药 手术后8周,30只兔子随机分为英夫利昔单抗10mg/mL(0.5mL)组、英夫利昔单抗20mg/mL(0.5mL)组和生理盐水(0.5mL)组,每组各10只,每月给药1次,共3次。

1.3 关节液中IL-1β、TNF-α、NO的测定 第1次给药3个月后,取关节积液,通过ELISA法测定IL-1β、TNF-α的含量,通过Griess法测定NO的含量。ELISA试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司。

1.4 软骨总体形态及微形态的观察 第1次给药3个月后,将动物处死,肉眼观察股骨软骨形态的变化。切取负重关节面带少量软骨下骨的全层软骨,无菌生理盐水冲洗后,10%中性缓冲甲醛固定液固定,5%甲酸甲醛脱钙液脱钙1周,加强梯度脱水。二甲苯I透明20分钟,浸蜡2小时,Leica EG1140H石蜡包埋仪包埋成石蜡块,制成石蜡切片。行HE染色,OLympus BH-2光学显微镜观察并拍摄照片。结果分析按照Mankin评分标准由两名观察者分别独立进行评分,取均值。

2 结 果

2.1 关节液中IL-1β、TNF-α、NO 的表达 表1显示各组关节液中IL-1β、TNF-α及NO表达水平,其中TNF-α及NO表达水平两治疗组均显著低于生理盐水组(P＜0.05),两治疗组之间无显著性差异(P＞0.05)。IL-1β的表达水平两治疗组与生理盐水组之间无显著性差异(P＞0.05)。

表1 各组关节液中IL-1β、TNF-α、NO浓度比较

2.2 软骨总体形态变化 正常兔膝关节软骨表面平滑有光泽,呈浅蓝白色。在生理盐水组中,软骨呈黄白色,无光泽,可见明显的裂缝和软骨缺失,股骨髁状突可见骨赘形成(见第467页图1A)。在两治疗组中,仍可见软骨丢失,但严重程度较生理盐水组明显减轻(见第467页图1B、图1C)。

2.3 软骨微形态变化 生理盐水组可见软骨很薄,溃疡深达钙化层伴软骨下骨暴露,部分可见软骨结构完全破坏,细胞数目大量减少,可见梭形细胞,HE染色减少,部分软骨不着色,潮线被破坏并可见钙化层与软骨下骨的破坏(见第467页图2A)。治疗组可见软骨较薄,裂隙可深至钙化层,部分区域软骨结构完全破坏,软骨细胞的数量减少,HE染色减弱,潮线被破坏并可见钙化层和软骨下骨的破坏,程度均较生理盐水组减轻(见第467页图2B、图2C)。Mankin's评分显示英夫利昔单抗10mg/mL组(2.7±0.9)、英夫利昔单抗20mg/mL组(2.4±0.7),明显低于生理盐水组(6.4±1.2)(P＜0.05)(表2)。两治疗组间比较差异无统计学意义。

表2 3组软骨组织学评分

3 讨 论

近年来生物因子在OA发病发展中的作用日益受到重视,生物因子网络失调与OA发病以及病程进展关系密切,IL-1β、TNF-α、NO作为体内重要的炎性介质,可导致基质金属蛋白酶(MMPs)的水平增高,从而诱导软骨细胞凋亡、造成关节软骨的损伤[4-5]。

本实验中发现英夫利昔单抗可有效的降低关节液中TNF-α、NO的表达水平,而对IL-1β的表达水平无显著影响。TNF-a和IL-1β是由OA患者软骨细胞产生的,可激活诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)表达,产生NO,从而诱导软骨细胞凋亡。目前,多数学者认为TNF-a和IL-1β等在关节软骨代谢方面处在炎症因子的上游,而NO在处于炎症因子的下游,起信使传递作用[6]。故认为英夫利昔单抗通过抑制TNF-α降低了NO的表达水平。

Mankin评分是研究软骨组织损伤程度的经典方法,结合软骨的结构、细胞数量、基质异染性和潮线完整性等四个方面进行评分。在本实验中发现,两治疗组在软骨总体结构、软骨微结构、Mankin评分等方面均优于生理盐水组,提示英夫利昔单抗能从组织学水平上改善兔骨关节软骨的损伤进程,无浓度依赖性,但是尚不能最终阻止软骨退变和发生发展的进程。

由于对OA确切的发病机制不清楚,目前对于OA的治疗上无论是药物还是手术都只能是对症处理,而不能从根本上针对OA的病因进行治疗。近年来随着对细胞因子(CK)、基质金属蛋白酶(MMPs)、生物自由基(如NO)及细胞凋亡在OA发病中的研究的深入,让人们看到了寻找在分子生物学水平上阻断骨关节炎发生发展的药物的希望,英夫利昔单抗有可能成为骨关节炎治疗的一种新的手段。

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