干扰STAT3的siRNA真核表达载体对人卵巢癌的侵袭转移性的相关研究

孙 静，邵淑丽

1.山西医科大学第二临床医学院，山西 太原 030001；2.山西省肿瘤医院妇科，山西 太原 030013

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，由于其早期症状不典型且较隐匿，较早就可发生转移和广泛播散，且目前仍缺乏早期有效的诊断技术，患者就诊时75%～85%皆已属临床晚期[1]，因而死亡率极高。近年来研究发现，信号传导和转录激 活 因 子3（signal transducer and activater of transcription，STAT3）信号转导通路在肿瘤的发生和发展中起重要作用[2]，特别是在促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、促进侵袭转移及免疫逃逸方面的作用尤为重要[3-4]。正常的卵巢细胞里无STAT3活化，而在多种卵巢癌细胞株中发现STAT3呈过度激活表达，本研究利用RNA干扰技术，构建siRNA（Small interference RNA）-STAT3来沉默STAT3癌基因的表达，从而了解STAT3对卵巢癌细胞体外侵袭与转移影响，为卵巢癌的基因治疗探索一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

pSilencer2.1-U6-neo质粒购自Ambion公司，各种酶为大连Takara生物公司产品，STAT3单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，LipofectamineTM2000脂质体购自Invitrogen公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人正常卵巢细胞均采用含10%FBS的RPMI1640细胞培养基，常规培养于5%CO2的37℃温箱中，每隔2 d更换细胞培养液，当细胞养至80%～90%融合时，用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 STAT3、siRNA转录模板的设计及合成[5]从GenBank中查找人STAT3基因的全长序列，根据siRNA的设计原则，设计STAT3特异寡核苷酸序列，在设计的寡核苷酸序列两端分别引入两个酶切位点，加入9个碱基对的茎环结构，3′末端加有转录终止序列TTTTT，以形成发夹状siRNA寡核苷酸链序列 ：STAT3 正 义 链 5′-GATCCATCCAGAGTCACTGGAAGTT TCAAGAGAAGTTCCAGTGA CTCTGGATTTTTTTGTCGACA-3′， 反义链 5′-AGCTTGTCGACAAAAAAATCCAGAGTCCACTGG AAC TTCTCTTGAAAGTTCCAGTGACTCTGGATG-3′。同时建立无同源性序列的non-target siRNA为阴性对照，正义链5′-GATCCTTCTCCGAACGTCTCACGTTTCAAGAGAACGTGCACGT TCGGAGAATTTTTTGTCGACA-3′， 反义链 5′-AGCTTGTCGA CAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGA CACGTTCGGAGAAG-3′（由上海博亚公司合成）。

1.2.3 siRNA-STAT3表达载体的构建 将合成的引物退火缓冲液作用下退火，与经过BglⅡ、HindⅢ双酶切的质粒pSilencer2.1-U6-neo连接，热转化至大肠杆菌DH5α中，37℃过夜培养，碱裂解法快速抽提质粒。

1.2.4 细胞转染 将处于对数生长期的SKOV3细胞和人正常卵巢细胞经0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种于24孔培养板，于37℃、5%CO2培养箱内培养，保证转染时细胞汇合达70%～80%；将LipofectamineTM2000用无血清培养液稀释，然后将稀释的siRNA-STAT3、空质粒与稀释的LipofectamineTM2000，轻轻混合均匀后放于 37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后，吸去无血清培养液，加入含10%FBS的细胞培养基继续培养。

1.2.5 Western blot检测STAT3蛋白的表达 实验分成五组：正常卵巢细胞对照组、正常卵巢细胞siRNA-STAT3组、SKOV3细胞对照组、SKOV3细胞空质粒转染组及SKOV3细胞siRNA-STAT3组。提取各组细胞总蛋白，定量后用蛋白上样缓冲液调整浓度，取25 μg上样，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，常规封闭后，加入一抗4℃过夜，再加入用辣根过氧化物酶标记过的二抗37℃下孵育2 h，ECL显色。

1.2.6 Transwell侵袭小室及侵袭相关蛋白MMP-2的检测将SKOV3细胞对照组、SKOV3细胞空质粒转染组及SKOV3细胞siRNA-STAT3组细胞用含1%FBS的培养基配制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×108个/L，取稀释好的Matrigel 25 μl加入Transwell小室底部膜的上室面，覆盖整个聚碳酯膜，放入37℃培养箱中孵育30 min，使Matrigel聚合成凝胶，取配制好的细胞悬液100 μl加入小室上室面，然后将24孔板下室加入600 μl含20%FBS的培养基于37℃、5%CO2培养箱内常规培养24 h后，取出小室上室，用PBS洗两遍，然后用湿棉签轻轻擦去凝胶和聚碳酯膜上的细胞，小心取出上室，用冰预冷的甲醇固定30 min后，行Giemsa染色。在高倍镜下（×200）随机选取10个不同视野的肿瘤细胞进行计数，取平均数。将三组细胞蛋白提取出后，按Western blot检测STAT3蛋白的表达的步骤检测侵袭相关蛋白MMP-2的表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.3统计软件进行分析，数据以均数±标准差（）表示，两样本均数比较采用 t检验，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测转染细胞STAT3蛋白的表达

正常卵巢细胞对照组、正常卵巢细胞siRNA-STAT3组、SKOV3细胞对照组、SKOV3细胞空质粒转染组和SKOV3细胞siRNA-STAT3组的STAT3蛋白相对表达量分别为（0.33±0.19）、（0.33±0.06）、（0.83±0.14）、（0.82±0.18）、（0.35±0.18）。SKOV3细胞siRNA-STAT3组STAT3蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 1。

图1 siRNA-STAT3对各组细胞中STAT3蛋白表达水平的影响

2.2 siRNA-STAT3对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

与SKOV3细胞对照组和SKOV3细胞空质粒转染组相比，SKOV3细胞siRNA-STAT3组穿过基底膜的细胞数显著减少（P＜0.05）。而SKOV3细胞阴性对照组和SKOV3细胞阴性对照组穿过基底膜的细胞数无明显差别。见表1。

2.3 siRNA-STAT3对卵巢癌细胞中侵袭转移相关蛋白表达水平的影响

SKOV3细胞siRNA-STAT3组中MMP-2蛋白的表达水平降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；而SKOV3细胞阴性对照组与SKOV3细胞对照组中MMP-2蛋白的表达无明显差异，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表2。

表1 不同组穿过基底膜的卵巢癌细胞数（）

表1 不同组穿过基底膜的卵巢癌细胞数（）

SKOV3细胞对照组SKOV3细胞空质粒转染组SKOV3细胞siRNA-STAT3组组别 穿膜细胞数（个/200倍视野）67.2±5.71 68.9±4.27 32.5±6.10

图2 siRNA-STAT3对卵巢癌细胞中MMP-2表达水平的影响

表2 不同组中MMP-2的表达量（）

表2 不同组中MMP-2的表达量（）

SKOV3细胞对照组SKOV3细胞空质粒转染组SKOV3细胞siRNA-STAT3组组别 MMP-2的相对表达量0.82±0.18 0.82±0.11 0.35±0.13

3 讨论

STAT3是近些年来发现的一种重要的核转录因子，是JAKs激酶-信号转导和转录活化因子（JAKs-STATs）转导途径中的一员，对肿瘤的发生发展起着重要作用。STAT3在人体正常组织中很少或没有活化，而在乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）、卵巢癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、宫颈癌、淋巴瘤、多发性骨髓癌和各种白血病等中存在持续激活的STAT3蛋白[6]，已被归为癌基因。Briggs等[7]发现，STAT3可在血管内皮生长因子（VEGF）基因启动子区域由结合位点持续激活，诱导VEGF表达，导致肿瘤新生血管形成，进而参与肿瘤的发生和发展。此外，基质金属蛋白酶类（MMps）中MMP-2的基因启动子内部也存在有STAT3的高亲和力结合位点，STAT3活化后能直接调节MMP-2表达，MMP-2参与对细胞外基质和基底膜的降解，促使卵巢癌细胞发生浸润与转移[8]。

RNA干扰（RNAi）是近些年来发现、逐渐发展起来的一种新兴基因阻断技术，它是将靶基因所对应的小分子双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA）导入有机体，通过降解细胞内同源mRNA来产生特异的基因沉默作用，进而阻断细胞中特定基因的表达[9]。Kunigal等人研究发现，应用RNAi技术沉默STAT3基因表达，能够抑制某些癌细胞增殖功能和诱导癌细胞发生凋亡[10-11]。

本实验利用RNA干扰技术，构建STAT3目的基因的发夹状siRNA表达载体，通过脂质体介导将siRNA-STAT3转染到卵巢癌SKOV3细胞中，使siRNA发挥沉默作用，抑制卵巢癌细胞中STAT3 mRNA的表达，阻断STAT3通路。同时，利用Transwell侵袭实验及对侵袭相关蛋白MMP-2表达水平的检测来判断其对卵巢癌细胞侵袭性与转移性的影响。实验结果表明：siRNA-STAT3组中STAT3蛋白表达水平降低、穿过人工基底膜的细胞数显著减少、侵袭相关蛋白MMP-2表达水平降低，表明干扰STAT3的表达能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的侵袭转移能力。在卵巢癌的治疗过程中，最关键的因素是控制肿瘤侵袭和转移。Vermeij等[12]在对52例浸润上皮性卵巢癌患者的检测发现，如果抑制STAT3的表达，可减少卵巢癌细胞的生长与侵袭转移发生。因此，STAT3有可能成为判断卵巢癌侵袭转移的一项重要指标，同时也为卵巢癌的基因治疗提供了新的途径。

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