反相高效液相色谱法测定根皮素溶解度

畅 敏，王庆伟，刘新友，张婷婷，李龙飞

第四军医大学唐都医院药剂科，陕西 西安 710038

根皮素（phloretin，Ph）是存在于苹果、梨等水果及多种蔬菜汁液中的类黄酮化合物，含有多个酚羟基，具有极强的抗氧化活性[1]。根皮素具有多种生物活性，对细胞无序增生有抑制作用，是食品中的抗诱变因子，可用于皮肤癌及其他肿瘤的治疗，是一种潜在的肿瘤治疗药物[2]；对骨质疏松、心血管硬化、高血脂症、肥胖以及老年痴呆症等疾病具有预防和治疗作用[3]。目前其研究引起了广泛关注，本文通过建立测定根皮素含量的方法，并测定在不同溶剂中的溶解度，为根皮素的进一步研究奠定基础。

1 仪器与试药

Agilent 1200液相色谱仪 （Agilent 1200泵、Agilent1200紫外检测器、Agilent 1200色谱工作站）；BP211D电子分析天平（德国Sartorius公司）；SHZ-B水浴恒温振荡器（上海跃进医疗器械厂）；TGL-16C型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

根皮素对照品（第四军医大学药学院药物化学教研室制备，经质谱、红外检定，HPLC测定含量为99.3%）；根皮素原料 （第四军医大学药学院药物化学教研室制备，含量为98.0%）；甲醇、乙腈均为色谱纯；乙醇、乙酸乙酯、氯仿、丙二醇、石油醚为分析纯；水为二次蒸馏水。

2 方法及结果

2.1 溶液的制备

精密称取10.00 mg根皮素对照品，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制备成1.00 mg/ml的根皮素母液，低温避光保存备用。取母液2 ml置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得0.20 mg/ml的根皮素储备液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Iinertsil ODS-3 柱 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.20%磷酸（40∶60，V/V）；流速为 1 ml/min；检测波长为286 nm；进样量为20 μl；温度为室温。在此色谱条件下，取适当浓度的根皮素对照品溶液进样测定，理论塔板数按根皮素峰计不低于1×104，对称因子为1.01，根皮素峰的保留时间为6.3 min，其杂质对主峰测定无干扰。见图1。

2.3 线性关系考察

精密量取根皮素对照品储备液于10 ml的容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀即得浓度分别为0.505、2.525、5.050、10.100、20.200、40.400、60.600 μg/ml的系列标准溶液。按照“2.2”项下的色谱条件检测，记录峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）作图进行回归，得回归方程为Y=88.85X+0.2221（r=0.9998）， 可见根皮素在 0.505～60.600 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度考察

精密量取根皮素对照品储备液适量，加甲醇溶解并定量稀释成10.10 μg/ml的溶液1份，连续进样6次，测定峰面积，RSD为0.09%，结果表明，在该色谱条件下仪器精密度良好。

2.5 重复性考察

精密量取根皮素对照品储备液适量，加甲醇溶解并定量稀释成10.10 μg/ml的溶液6份，按照“2.2”项下的色谱条件检测，计算峰面积的RSD为0.78%，表明本法重复性良好。

2.6 稳定性考察

精密量取根皮素对照品储备液适量，加甲醇溶解并定量稀释成 10.10 μg/ml的溶液，按照“2.2”项下色谱条件于 0、1、2、4、6、12 h分别进样测定，记录峰面积，根皮素峰面积RSD为0.31%，表明根皮素溶液在12 h内稳定。

表1 不同溶剂中根皮素的溶解度（25℃）

2.7 溶解度测定[4-5]

将过量的根皮素置具塞试管中，分别加入适量的水、乙醇、丙二醇、石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷，超声至不再溶解，放入振荡器（100 r/min）中，（25±1）℃振摇 24 h，待溶解平衡后，取出根皮素的饱和溶液，置于离心机，10000 r/min离心10 min，精密吸取上清液，用甲醇定量稀释后进样测定，由标准曲线计算根皮素在不同溶剂中溶解度。平行试验3次。见表1。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

通过紫外全波长扫描发现根皮素的最大吸收波长为225 nm和286 nm，在286 nm波长下仪器噪音响应小，基线平稳，故选择286 nm作为根皮素的紫外检测波长。

3.2 流动相的选择

实验中比较了甲醇-水、乙腈-水两个洗脱系统，结果发现乙腈-水系统对得到的色谱峰峰形及分离度较好。流动相中加入磷酸对分离效果及前沿现象有很大改善，最终以乙腈-0.20%磷酸水溶液为流动相，得到的色谱峰峰形对称，分离效果最佳。

3.3 溶解度实验

溶解度试验结果表明，根皮素在醇中的溶解度较高，在水和石油醚中溶解度极低，可见根皮素为水和酯都难溶的化合物。根据相似相容原理，根皮素结构中含有多个酚羟基，所以根皮素易溶于醇类。

通过建立根皮素的高效液相测定方法，并对其在不同溶剂中的溶解度的测定，为进一步分析测定根皮素、剂型研制及药动学研究提供依据。

[1]LU Xiaoyu,ZENG Yaoying,YE Yanxia,et al.Anti-inflammatory and immunosuppressive effect of phloretin [J].Acta Pharmaceutica Sinica,2009,44(5):480-485.

[2]罗辉,汪亚君,陈杰,等.根皮素抑制肝癌细胞恶性表型的研究[J].中药材,2008,31(7):1019-1021.

[3]徐凯,吕海涛.苹果皮中根皮素的提取工艺研究[J].食品研究与开发,2009,30(12):109-111.

[4]王庆伟,梅其炳,刘雪英,等.染料木黄酮的物化常数测定[J].中国医院药学杂志,2003,23(12):729-730.

[5]王弘,陈济民,张清民.黄芩苷的物化常数测定[J].沈阳药科大学学报,2000,17(2):105-106.