联合应用sIL-5Rα及 sIL-13Rα2对哮喘小鼠IgE、INF-γ水平的影响

杨学敏 史海广 成家军 李志奎

哮喘是一种由多种炎症介质、炎症细胞和细胞因子参与的气道慢性炎症疾病，近年来发病率急剧增加，给人们的健康带来极大危害［1］，因此迫切需要新的治疗方法。哮喘发病机制复杂多样，目前认为Th1/Th2反应失衡导致Th1功能相对抑制，Th2功能相对亢进是其重要的发病机制之一。Th1分泌的INF-γ在细胞内具有吞噬微生物的功能，并与Th2产生的IL-4具有对抗作用。而IL-4、IL-5、IL-13是经典的Th2细胞因子，参与B细胞分化、促使IgE分泌增加、嗜酸性粒细胞活化和聚集、黏液分泌增加及气道高反应性，在哮喘发病中起到重要的作用，因此IL-5、IL-13成为新的哮喘治疗靶点。本实验联合应用sIL-5Rα及sIL-13Rα2治疗哮喘小鼠，观察其支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)及血清中 IgE、INF-γ 水平变化。

材料与方法

一、实验材料

1.动物:6～8周龄BALB/c小鼠50只，雌性，体重(22±3)g，来源于第四军医大学实验动物中心，非含卵蛋白饲料喂养，饲养环境为温度23±2℃，湿度(55.5±10%)。

2.药物和试剂:卵白蛋白(OVA)(美国Sigma公司)，氢氧化铝(Al(OH)3)，生理盐水，sIL-5Rα、IL-13 sR α2(本课题组实验合成)，ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。

3.主要仪器:402型超声雾化器(上海四菱医疗器械厂)，美国BeckmanJ 2型低温高速离心机，酶标仪型(Thermo公司)。

二、实验方法

1.实验动物分组:实验小鼠随机分为5组，每组10只，即正常组、哮喘组、sIL-5Rα治疗组、sIL-13Rα2治疗组及联合治疗组。

2.哮喘模型制备及干预:各组小鼠(正常对照组除外)分别于第0、7、14天腹腔注射20 μg OVA和20 mg氢氧化铝凝胶0.9%氯化钠混合液200 μl致敏，正常对照组腹腔注射相同体积0.9%氯化钠溶液。第21～27天将小鼠(正常组除外)置于封闭容器中，超声雾化吸入5%OVA生理盐水诱发哮喘，每天诱发1次，每次30 min，其中sIL-5Rα治疗组、sIL-13Rα2治疗组及联合治疗组分别于诱发前30 min给予腹腔注射100 μg sIL-5Rα、sIL-13Rα2及联合应用sIL-5Rα及sIL-13Rα2各100 μg，正常组和哮喘组激发前30 min给予腹腔注射相同体积生理盐水，共7 d，正常组用生理盐水代替OVA进行激发。

3.样本采集:末次激发24 h后，经小鼠眼球取血，静置1 h后，3000 r/min离心15 min留取血清，将血清置于-20℃冰箱中保存备用。小鼠气管插管，Hanks液0.5 ml灌洗，回收灌洗液，重复3次，1500 r/min离心10 min，收集上清液，-20℃冷冻保存备用。

4.细胞因子的测定:采用双抗体夹心酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法，检测血清及BALF中IgE、INF-γ水平，操作严格按照说明书进行。

三、统计学处理

结 果

一、症状观察

哮喘组小鼠逐渐出现烦躁不安、抓鼻、抓脸、呼吸加深加快、腹肌抽搐、大小便失禁、哮鸣音等阳性反映，提示哮喘模型建立成功。sIL-5Rα治疗组、sIL-13Rα2治疗组小鼠可见轻度烦躁不安、呼吸加快、腹肌抽搐等反应，提示治疗有效。联合治疗组与正常组症状上基本无差异，未见上述症状，提示联合治疗效果更佳。

二、对IgE及INF-γ水平的影响

试验中各组小鼠BALF及血清中IgE、INF-γ水平变化如表1所示。与正常组比较，哮喘组BALF及血清中IgE均明显增高，INF-γ均明显下降(P＜0.01);与哮喘组比较，sIL-5Rα治疗组、sIL-13Rα2治疗组及联合治疗组IgE亦明显降低，INF-γ明显增高(P＜0.01);与sIL-5Rα治疗组及sIL-13Rα2治疗组比较，联合治疗组IgE均亦明显下降，INF-γ明显增高(P＜0.01)。

讨 论

哮喘是一种以嗜酸性粒细胞聚集、杯状细胞过度增生、黏液分泌增加以及气道高反应性为主要特征的慢性炎症性疾病，主要是Th2细胞因子IL-4，IL-5，IL-13产生增多，而Th1细胞因子IFN-γ产生减少，从而导致B细胞合成增多，嗜酸性粒细胞活化浸润气道造成的气道高反应性［2］。嗜酸性粒细胞是过敏性及内源性哮喘的标志物，是过敏性哮喘主要的效应细胞［3］。IL-13可活化嗜酸性粒细胞，延长其存活时间并呈浓度梯度依赖关系;同时IL-5也是重要的嗜酸性粒细胞趋化物质，IL-13与IL-5在活化嗜酸性粒细胞中具有协同刺激作用。嗜酸性粒细胞还可以释放细胞因子IL-3和IL-5，引起进一步的嗜酸性粒细胞产生和移行，并且合成和释放脂质介质。以往的研究中发现sIL-5Rα、sIL-13Rα2可有效降低哮喘小鼠血清中IL-5、IL-13水平，从而抑制嗜酸性粒细胞的增加，达到缓解哮喘气道高反应性等哮喘症状［4］。从本实验症状观察上也可说明这一点。

研究发现:IgE是介导Ⅰ型超敏反应的重要介质，当机体接触过敏原时，IgE交联导致肥大细胞和嗜酸性粒细胞脱颗粒释放炎症介质引起强烈的、以嗜酸性粒细胞浸润为主的局部炎症反应。这种炎症反应是哮喘的生理学和临床表现的物质基础，表现为气道高反应性和发作性的咳嗽、喘息、胸闷的等症状。IL-4、IL-13具有免疫调节作用，可促进B细胞增值分化、提高B细胞活性和直接诱导B细胞合成过多IgE［5］。而IL-5在IL-4依赖的IgG1分泌性细胞中具有引导作用，与其在B-2细胞分化中有协同作用，与IL-4的表达存在相关关系［6］。IL-5能协同IL-4促进B细胞生成IgE。当IL-5与IL-4同用于刺激B细胞时，合成IgE的能力可比单用IL-4时增加9～14倍，因此，IL-5在IgE介导的Ⅰ型过敏反应中具有重要的作用。本研究中联合治疗组BALF及血清中IgE水平明显降低，并且与哮喘组、sIL-5Rα治疗组及sIL-13Rα2治疗组比较均有显著性差异。其机制可能是由于联合治疗组通过抑制IL-5、IL-13细胞因子水平，并且使Th1/Th2细胞比例失衡向正常方向发展，提高IFN-γ的水平，干预IgE的产生。

表1 各组小鼠BALF及血清中IgE、INF-γ水平变化(，n=10)Table 1 The changes of IgE，INF-γ in BALF and serum in mice(，n=10)

表1 各组小鼠BALF及血清中IgE、INF-γ水平变化(，n=10)Table 1 The changes of IgE，INF-γ in BALF and serum in mice(，n=10)

注:与正常对照组比，aP ＜0.01;与哮喘组比，bP ＜0.01;与联合治疗组比，cP ＜0.01

研究证实:IFN-γ主要由活化的CD4+Th1细胞分泌，IFN-γ增加细胞表面MHC分子、细胞因子的产生和巨噬细胞活性，使免疫反应增强，抑制Th0向Th2分化，抑制IL-4、IL-5、IL-l3等细胞因子产生，进而抑制IgE产生和EOS活性，是哮喘免疫调节中的一个十分重要的抑制因子，许多细胞因子均通过它而发挥生物作用［7］。另外IFN-γ还能显著抑制成纤维细胞的增生及胶原的合成，促进成纤维细胞的凋亡及受损肺泡上皮的修复，并抑制转化生长因子-β的表达［8］。免疫失调是哮喘的重要发病机制，哮喘发作时体内Th1/Th2细胞比例失衡，Th1细胞合成减少，导致其分泌的IFN-γ相对减少，此为哮喘的重要发病机制之一。本研究结果显示联合治疗组BALF及血清中IFN-γ水平明显高于哮喘组、sIL-5Rα治疗组及sIL-13Rα2治疗组。其机制可能是由于常态时Th1/Th2细胞之间处于相互抑制状态，而在哮喘小鼠中Th2细胞占优势，抑制了Th1细胞分泌，导致其分泌的IFN-γ减少［9］。而联合治疗组通过抑制IL-5、IL-13细胞因子的合成，使Th2优势状态向Th1优势发展，Th1分泌增加，从而使IFN-γ合成增减加。

本研究结果表明，联合应用sIL-5Rα及sIL-13Rα2治疗哮喘小鼠可显著降低BALF及血清中IgE含量及升高IFN-γ含量，从而改善和缓解哮喘症状，较单独治疗效果更明显，其有望成为哮喘治疗又一条有效途径。

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