卡泊芬净合成前体Pneumocandin B0的发酵工艺研究

刘 靓，娄 忻，张 莉，关亚鹏

(华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心，河北 石家庄 050015)

卡泊芬净(Caspofungin,代号MK-0991)是新型抗真菌化合物棘白霉素类中第一个用于临床的药物。2001年11月美国FDA和欧洲已批准用于两性霉素B治疗无效或不能耐受两性霉素B的侵袭性曲霉病患者[1]。卡泊芬净是葡聚糖合成酶抑制剂，非竞争性地抑制真菌细胞壁的1，3-β-D-葡聚糖的合成，从而发挥杀菌作用[2]，它是天然产物Pneumocandin B0的半合成衍生物。作者以Pneumocandin B0PB5-31为出发菌株，从选育高产菌株和提高产物中有效组分的比例两方面进行研究，以期提高Pneumocandin B0的发酵水平。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌种

供试菌株为Pneumocandin B0PB5-31。

1.1.2 培养基

(1)分离及斜面培养基：PDA 。

(2)种子培养基：可溶性淀粉、蛋白胨、棉籽饼粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、玉米浆、碳酸钙。

(3)发酵培养基：甘露醇、葡萄糖、棉籽饼粉、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁。

1.2 方法

1.2.1 摇瓶培养

1.2.1.1 摇瓶种子培养

250 mL三角瓶内装40 mL培养基，接入成熟的斜面孢子，25 ℃、220 r·min-1下摇床培养约48 h。

1.2.1.2 摇瓶发酵培养

250 mL三角瓶内装40 mL培养基，接入成熟的种子，25 ℃、220 r·min-1下摇床培养约180 h。测定发酵液效价。

1.2.2 菌种诱变与筛选

1.2.2.1 单孢子悬浮液制备

将Pneumocandin B0PB5-31孢子斜面加蒸馏水10 mL，制成孢子悬浮液，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，然后用玻璃纤维过滤，制成单孢子悬浮液，供诱变处理使用。

1.2.2.2 氯化锂敏感度测试

选用氯化锂浓度为0.40%、0.50%、0.60%进行测试处理。氯化锂与分离培养基按上述比例混合后，倒制平板，涂布孢子液。培养3～5 d，从菌落生长情况观察其对氯化锂的敏感度；10 d左右观察菌落形态。挑选单菌落进行摇瓶发酵培养，测定效价，比较突变株和对照株。

1.2.2.3 紫外线诱变复合氯化锂处理[3]

(1)紫外线诱变：取孢子悬浮液5 mL吸入已灭菌的空平皿中，放入紫外照射箱中(紫外照射箱应至少提前30 min开启)，平皿距离紫外灯28 cm，打开平皿盖，紫外灯照射4 min，盖上平皿盖，取出。稀释，涂布于空白培养皿中培养。

(2)氯化锂前处理复合紫外线诱变：制成0.50%氯化锂单孢子悬浮液，于25 ℃振荡萌发孢子6 h，取10 mL吸入已灭菌的空平皿中，放入紫外照射箱中(紫外照射箱应至少提前30 min开启)，平皿距紫外灯28 cm处照射4 min，盖上平皿盖，取出。稀释，涂布于空白培养皿中培养。

(3)紫外线诱变复合氯化锂后处理：将经紫外诱变处理后的孢子液稀释，涂布于上层含0.50%氯化锂的培养皿中培养。

1.2.3 脯氨酸的添加

在发酵培养基中添加脯氨酸，添加量分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，其它成分含量不变。摇瓶发酵，测定有效组分B0与无用杂质A0(后续提取纯化中很难分离)的比率，确定适宜的脯氨酸添加量。

1.2.4 样品检测

发酵液倒入刻度离心管中，3000 r·min-1离心10 min，取上清液HPLC检测。沉淀部分所占体积与总取样体积的比值即为Pmv(%)。

2 结果与讨论

2.1 氯化锂敏感度测试

以Pneumocandin B0PB5-31为出发菌株，用不同剂量的氯化锂处理，结果见表1。

表1 氯化锂敏感度测试结果/%

由表1可知，氯化锂作为单一的因子，本身并无诱变作用。

2.2 紫外线诱变复合氯化锂处理

以Pneumocandin B0PB5-31为出发菌株，分别采用单一紫外线诱变、氯化锂前处理复合紫外线诱变、紫外线诱变复合氯化锂后处理，以未经处理的单孢子悬浮液涂布于空白平板作为对照，结果见表2。

由表2可知，虽然氯化锂本身并无诱变作用，但与紫外线诱变具有协同作用。氯化锂前处理复合紫外线诱变和紫外线诱变复合氯化锂后处理诱变效果均好于单一紫外线诱变，且紫外线诱变复合氯化锂后处理效果更好，正向变异的幅度更大。

表2 紫外线诱变复合氯化锂处理的结果

2.3 摇瓶筛选菌株比较

以Pneumocandin B0PB5-31为出发菌株，经单一紫外线诱变处理后筛选出正突变率高的UV-Ⅰ突变株，经氯化锂前处理复合紫外线诱变、紫外线诱变复合氯化锂后处理分别筛选出正突变率高的LiCl-UV-Ⅱ突变株、UV-LiCl-Ⅲ突变株，与出发菌株Pneumocandin B0PB5-31进行对比，结果见表3。

表3 摇瓶筛选菌株比较

由表3可知，经紫外线诱变复合氯化锂后处理筛选出的突变株UV-LiCl-Ⅲ的发酵水平最高，比出发菌株提高了72%。

2.4 脯氨酸添加量的影响(表4)

表4 脯氨酸添加量的影响

由表4可知，脯氨酸可以很好地提高有效组分B0的比例。当脯氨酸添加量为0.3%时，B0∶A0最高，达3.28；继续增大脯氨酸添加量，B0∶A0反而有所下降。

微生物代谢过程是一系列生化反应的总和，因而在培养液中所分泌的代谢产物不可能是单一的化合物，而是一种混杂体。以抗生素而言，发酵液中包含有多种组分，虽然其分子结构大同小异，但抗菌活性差异极大。生产所需要的产品成分为有效组分，而那些无抗菌活性及抗菌活性差的非产品成分则为杂质。只有提高有效组分的比例，才可能提高成品的收率，从而提高产品质量。提高发酵液中有效组分比例的方法有很多，本研究通过发酵培养基中适量添加脯氨酸提高了有效组分B0的比例。

3 结论

以Pneumocandin B0PB5-31为出发菌， 通过紫外线诱变复合氯化锂后处理筛选出高产菌株UV-LiCl-Ⅲ，其发酵效价比出发菌株提高了72%。表明紫外线诱变复合氯化锂后处理是筛选获得Pneumocandin B0高产菌株的有效手段。发酵培养基中添加0.3%的脯氨酸很好地提高了有效组分B0的比例。

[1] New antimicrobial agents approved by the U.S.Food and Drug Administration in 2001 and new indications for previously approved agents[J].Antimicrob Agents Chemother，2002,46(4):1160.

[2] 高磊.新型抗真菌药物—卡泊芬净[J].临床药物治疗杂志，2005，3(5)：55-58.

[3] 刘颐屏.抗生素菌种选育的理论和技术[J].中国医药科技出版社.

[4] 吴雪昌，汪志芸，周婕，等.提高产抗生素链霉菌紫外诱变正变率的研究[J].遗传，26(4)：499-504.