PHB产生菌发酵条件的研究

涂 毅，王玮玥，张 弘，魏 凯，来晨刚，曹军卫

(武汉东湖学院生命科学与化学学院，湖北 武汉 430212)

由于石化塑料的难降解性，大量废弃塑料流入自然界，造成严重的环境污染，而聚-β-羟丁酸(Poly-β-hydroxybutyrate，PHB)是一种在生态环境中能被完全降解为水和二氧化碳的生物材料，因此是一种可以替代石化塑料的理想的生物可降解塑料。PHB不仅可以用于轻工、化工、食品、农业等现行的塑料应用行业，还可用于医疗卫生、高新技术产品研制等领域。

自1926年首次发现PHB以来，各国学者对其进行了大量的研究，包括产生PHB的微生物，PHB的合成途径、形成动力学和机制，PHB的结构、分子量及生物降解特性等多方面[1,2]。美、德、韩、奥地利等国都已广泛开展PHB的研究[3,4]。国内关于PHB研究的报道并不太多，上海有机所、中科院成都生物所、中科院微生物所、山东大学微生物系偶有PHB研究的信息[5～9]。能合成PHB的微生物分布极广，包括自养和异养、光能和化能菌等，目前已经发现共计65个属中的多个种，其中既有革兰氏阴性菌，也有革兰氏阳性菌[10～15]。

PHB的分子量一般为106Da，熔点为180 ℃，具有高结晶性、光学活性和压电性质，是立体规整的聚合物。如果单体的碳链长度增加，其柔韧性将会大大增强，而熔点及结晶度下降。PHB作为塑料，最好具有60万Da以上的分子量[16]。

神农架林区是一个有着丰富微生物资源的地区，本课题组从神农架林区不同地点采集了多份土壤样本，从中分离得到产生PHB的菌株，并探讨了产PHB菌的最佳发酵条件，从而提高菌株的PHB积累量。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌株

从神农架林区采集的土样中分离得到。

1.1.2 培养基

无氮培养基[17]：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.2 g，CaCO35 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0，113 ℃灭菌30 min。

平板培养基[17]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，酵母膏 3 g，葡萄糖5 g，蒸馏水1000 mL，pH值7.0，121 ℃灭菌20 min。

种子培养基(g·L-1)[14]：酵母膏10，蛋白胨10，牛肉膏5，硫酸铵5，葡萄糖10，pH值7.0。

基础发酵培养基(g·L-1)[17]：蛋白胨5，酵母膏1，甘油5，葡萄糖5，pH值7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离

将从神农架林区采集的土样分别标记为1#、2#、3#、4#、5#、6#。每份土壤取少量加入50 mL的无菌生理盐水，混匀，取10 mL上清液接入到无氮液体培养基中，30 ℃摇床振荡培养48 h。

用10倍稀释法将上述PHB产生菌富集液稀释后接种到平板上，于30 ℃培养1～2 d后，挑取单菌落，接种到种子培养基中活化，32 ℃培养24 h后，在235 nm波长处测定其吸收值。然后接种到基础发酵培养基中，32 ℃摇瓶培养144 h，不同时间取样，测定生长曲线和PHB产量。

1.2.2 PHB的测定

取发酵液12 000 r·min-1离心收集细胞，用氯仿水浴加热后，离心，取上清液，真空抽干氯仿，白色颗粒即为PHB粗提物。

PHB粗提物中加入10 mL浓硫酸，100 ℃加热10 min，冷却后在235 nm波长处测定其吸收值[17]。

1.2.3 发酵条件的优化

采用L9(34)正交表，以基础发酵培养基为基础，设定碳源、氮源、pH值3因素3水平的9种不同配方配制培养基，32 ℃培养6 d，提取PHB后在235 nm波长处测定其吸收值，确定产PHB菌的最适发酵条件。正交实验的因素和水平见表1。

表1 正交实验因素与水平

2 结果与讨论

2.1 菌株的分离与PHB的测定

按照1.2.1方法，从2#、3#、4#土样中均分离到了单菌落，挑取单菌落进行培养，重新编号为SNJD-3-Ⅰ、SNJD-3-Ⅱ、SNJD-3-Ⅲ。培养后分别提取PHB，在235 nm波长处都有吸收值，证明分离得到的三株菌都是产PHB的菌株。

挑取待测菌株，接种到种子培养基中活化，32 ℃培养24 h后，按照培养基体积5%接种到基础发酵培养基中，32 ℃摇瓶培养。从第3 d起每天取样提取PHB，测定OD235值；同时取样测定560 nm处培养基的吸光值，绘制细菌生长曲线和PHB产量的进程曲线，结果见图1。

图1 三株菌的PHB产量及其生长曲线

由图1可知，SNJD-3-Ⅰ和SNJD-3-Ⅱ菌株的PHB产量在培养至第6 d时达到最大，此时菌株生长进入稳定期，PHB的积累量达到最大，第7 d明显下降。SNJD-3-Ⅲ菌株的生长在第5 d之后进入衰亡期，可能由于SNJD-3-Ⅲ菌的稳定期很短，不到24 h。而在菌株已经进入衰亡期后，PHB的积累量还在不断增加。

2.2 菌种鉴定

取生长比较好的SNJD-3-Ⅰ菌株显微镜观察，革兰氏染色呈阳性，杆菌，并有芽孢产生，初步鉴定为芽孢杆菌属。

2.3 发酵条件的优化

取生长比较好的SNJD-3-Ⅰ菌株进一步研究。根据基础发酵培养基[17]，碳氮比大约为2∶1，因此按比例确定氮源为0.5 g、碳源为1.0 g，定容到50 mL。

正交实验结果见表2。

表2 正交实验结果

运用SPSS统计分析软件分析表2数据，绘制方差分析表，见表3。

表3 正交实验的方差分析

由表3可知，碳源、氮源、pH值3个因素中，氮源的P值<0.05，表明氮源的3个水平间有显著差异，即氮源种类的选择对实验结果有显著性影响。因此，根据各因素的最优水平，确定SNJD-3-Ⅰ培养的最佳条件是：葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，pH值为7.0。

在最佳条件下，32 ℃摇床培养6 d后提取PHB，测其OD235值为2.398，大于正交实验中9个不同培养条件下PHB的OD235值，说明在此最佳培养条件下生长的菌株所积累的PHB的量最多，证明正交实验所优化的结果确为SNJD-3-Ⅰ的最优发酵条件。

对照PHB标准曲线来判断PHB含量[18]。根据测得的最佳培养条件下的PHBOD235值(2.398)， 计算得SNJD-3-Ⅰ菌株所积累的PHB量为14.72 g·L-1。

3 结论

从神农架林区采集的土样中分离出了可以在细胞内积累PHB的菌株，分析它们产生PHB的能力，并对其中3个菌株的生长曲线和PHB产量进行比较，其中SNJD-3-Ⅰ和SNJD-3-Ⅱ的PHB积累量都在第6 d达到最大，第7 d明显下降，而SNJD-3-Ⅲ的PHB产量在生长曲线出现明显下降后仍呈上升趋势。对SNJD-3-Ⅰ进行革兰氏染色，镜检观察其为革兰氏阳性菌，杆菌，并有芽孢产生，初步鉴定为芽孢杆菌属。通过正交实验确定了SNJD-3-Ⅰ产PHB的最佳发酵条件，即以基础发酵培养基为基础、葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源时，控制碳氮比为2∶1，pH值7.0，32 ℃振荡培养6 d，在该条件下所积累的PHB量为14.72 g·L-1。

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