微波辅助提取汉防己总生物碱及其中汉防己碱含量的测定

2011-07-25李会鹏廖克俭

化学与生物工程 2011年3期

赵华，李会鹏，廖克俭

(辽宁石油化工大学石油化工学院，辽宁抚顺 113001)

汉防己为防己科千金藤属植物粉防己(Stephaniatetrandra.S.Moore)的块根，具有抗菌、消炎、抗过敏、抗肝纤维化[1]、抗矽肺及逆转肿瘤化疗多药耐药性[2，3]、去屑止痒等功效。汉防己碱有效成分为生物碱，总生物碱含量达1.5%～2.3%，其中汉防己甲素(Tetrandrine，汉防己碱)约1%、汉防己乙素(Fangchinoline)约0.5%。目前汉防己甲素、乙素多采用乙醇提取，提取液经酸碱处理，再用氯仿萃取，或直接改用氨水碱化得总生物碱等[4]。微波技术已广泛应用于中药和天然产物生物活性成分的提取，如黄酮类、苷类、多糖、萜类、挥发油、单宁、甾体及有机酸等[5，6]，但用于汉防己总生物碱的提取还鲜有报道。

作者采用微波辅助法提取汉防己有效成分，通过单因素实验和正交实验优化提取工艺条件，并建立了HPLC法测定汉防己总生物碱中汉防己碱的方法，为其进一步开发利用提供科学依据。

1 实验

1.1 材料、试剂和仪器

汉防己，市售。

汉防己碱对照品(含量99.8%)，中国药品生物制品检定所。

无水乙醇(含量99.7%)、丙酮、盐酸、氨水，分析纯；乙腈，色谱纯；水为超纯水。

79-1型磁力加热搅拌器、YXYQ型循环水多用真空泵，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；恒温培养箱，辽阳市恒温仪器厂；WD 800 G(2450 MHz)型微波炉，佛山格兰仕电器厂；LC-10A型高效液相色谱仪，日本岛津。

1.2 方法

准确称取汉防己粉末10 g，放入烧杯中，加入一定量一定体积分数的乙醇溶液，摇匀，静置10 min，放入微波炉中加热，设定功率，每次辐射1 min，间隔1 min后再辐射1 min，如此间隔辐射直至总时间达到实验设定值，抽滤。按同样条件重复提取一次。合并两次滤液，减压蒸馏至无醇味。将剩余液倒入烧杯，加入10 mL 1%盐酸，静置48 h后用滤纸过滤去除沉淀，用浓氨水调滤液pH=9，放置48 h后抽滤，沉淀干燥后，用1.5 mL丙酮加热溶解，在溶液中滴1～2滴蒸馏水至溶液微浊，放置待溶液挥干得白色结晶[7]，即汉防己总生物碱。

汉防己总生物碱提取率依下式计算：

1.3 提取工艺优化

1.3.1 单因素实验

按1.2方法，固定其它因素不变，依次改变乙醇体积分数(A)、液料比(B，mL∶g，下同)、提取时间(C)、微波功率(D)，考察其对汉防己总生物碱提取率的影响。

1.3.2 正交实验

基于单因素实验结果设计L9(34)正交实验，每个实验重复3次，取平均值。正交实验的因素和水平见表1。

表1 正交实验的因素和水平

1.3.3 对比实验

准确称取汉防己粉末10 g，放入烧杯中，用55%的乙醇[500 mL·h-1，300 mL·(45 min)-1，200 mL·(30 min)-1]提取3次，合并提取液，回收乙醇至无醇味。其余步骤同1.2。

将实验结果与优化微波提取条件下的结果进行对比。

1.4 汉防己总生物碱定性检验

基于汉防己总生物碱与碘化铋钾、冰醋酸反应产生桔红色浑浊或沉淀，定性检测提取物中是否含有汉防己总生物碱[8]。

1.5 HPLC法测定汉防己碱含量

1.5.1 色谱条件

色谱柱ODS C18柱(4.6 mm×150 mm)；流动相：十二烷基磺酸钠-乙腈-0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液 (0.15∶50∶50，pH=2)；流速：1.0 mL·min-1；紫外检测波长：240 nm；进样量：20 μL；检测器灵敏度：0.001 AUFS。

1.5.2 对照品溶液的制备

精密称取汉防己碱对照品10.00 mg，置于100 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置于10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得20.0 μg·mL-1的汉防己碱对照品溶液。将此对照品溶液进一步稀释至3.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1、9.0 μg·mL-1、12.0 μg·mL-1和15.0 μg·mL-1。

1.5.3 供试品溶液的制备

精密称取实验提取的总生物碱20.00 mg，置于100 mL量瓶中，加流动相溶解后稀释至刻度，摇匀，用孔径为0.45 μm的微孔滤膜过滤，量取滤液1 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得20.0 μg·mL-1的供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 汉防己总生物碱的提取工艺

2.1.1 单因素实验结果

单因素实验结果表明：随着乙醇体积分数的增大，汉防己总生物碱提取率逐渐上升，乙醇体积分数为60%时，提取率最高；液料比为13∶1时，汉防己总生物碱提取率最高，但溶剂用量太多，回收溶剂所需蒸馏时间太长，会造成部分损失；汉防己总生物碱提取率随提取时间的延长而上升，提取时间为4 min时，达到最高，但是微波作用时间过长，会导致其它副产物产生；微波功率为320 W时，汉防己总生物碱提取率最高，但功率过大时，加热升温过快，溶液易沸腾而喷出，造成提取液损失。

2.1.2 正交实验结果与方差分析(表2、表3)

表2 正交实验的结果与分析

给定α=5 %，查表得Fα(2，2)=19。由表3可知，FB>19、FD>19，表明液料比和微波功率对提取率有显著影响。综合考虑，确定最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数55%、液料比13∶1(mL∶g)、提取时间3.5 min、微波功率480 W。

表3 方差分析

2.1.3 对比实验结果(表4)

表4 微波辅助提取法和乙醇回流法结果对比

由表4可知，在乙醇体积分数和液料比相同的情况下，微波辅助提取法不仅提取率高，而且时间大大缩短，能耗省、成本低，优势明显。

2.2 汉防己总生物碱的定性检测

取少量提取液加入碘化铋钾、冰醋酸，产生桔红色浑浊或沉淀，说明提取物中含有汉防己总生物碱。

2.3 HPLC法测定汉防己总生物碱中的汉防己碱含量

2.3.1 标准曲线

以测得峰面积积分值为纵坐标、汉防己碱进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线，拟合线性回归方程为：y=247.5x+24.3，相关系数R=0.9967 (n=5)，表明汉防己碱在0.06～0.30 μg(即6.0～30.0 μg·mL-1)范围内线性关系良好。

2.3.2 稳定性

精密吸取供试品溶液20 μL，每间隔60 min进样测定，结果表明供试品溶液在5 h内基本稳定，RSD=0.98%，n=6。

2.3.3 精密度

精密吸取对照品溶液20 μL，重复进样5次，测定峰面积积分值分别为73.5、72.3、71.8、72.7和72.4，RSD=0.87%，n=5。

2.3.4 重现性

取汉防己总生物碱样品5份，精密称定，分别制备成供试品溶液进行测定，峰面积积分值分别为73.6、72.8、71.9、73.2、72.1，RSD=0.99%，n=5，表明方法的重现性好。

2.3.5 回收率

取已知含量的汉防己碱供试品溶液 6份，每份加入一定量汉防己碱对照品溶液，进行含量测定，平均回收率为99.98%，RSD=1.66%。表明加样回收率良好。

2.3.6 汉防己碱的含量测定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示。

a-汉防己碱峰

由图1可知，图谱中出现的保留时间差异不大，色谱分离的汉防己碱标准品峰形对称，并与相邻杂质峰能够达到基线分离，定量值准确。汉防己碱含量为标示量的101.2%。按外标法计算，微波辅助提取法和乙醇回流法得到的汉防己总生物碱中汉防己碱的含量分别为56.55%和52.25%，即2.525 mg·mL-1和2.020 mg·mL-1，说明微波提取更利于有效成分的提取。