灵芝多糖体外抗氧化活性的研究

张志军，李淑芳，魏雪生，陈晓明

(天津市林业果树研究所，天津 300112)

在生物体生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种自由基。自由基不仅是生物体多种生理功能的启动因素和生化反应的介导者，同时也在免疫细胞因子网络中起调节、信号转导作用[1]。现代生命科学、医学研究表明，随着年龄的增长，人类机体内自由基的自稳态平衡性下降，从而导致自身免疫功能下降，发生肿瘤、动脉粥样硬化、原发性高血压、Alzheimer型早老性痴呆等自由基疾病[2，3]。

灵芝(Ganodermalucidum)在我国自古就有“仙草”的美誉，已有悠久的药用和食用历史，《神农本草经》、《本草纲目》中都有灵芝的药效记载[4]。多糖是灵芝中的主要活性组分之一。20世纪70年代以来，灵芝多糖的研究开发进入了一个崭新的发展时期，经过近30年的发展，人们对灵芝多糖这一重要生命物质产生了新的认识[5]。据报道，从双孢蘑菇、灵芝、香菇、侧耳等6种真菌中提取出的活性成分，可以防止细胞内DNA的氧化损伤。刘志峰等研究证明，蘑菇提取物对脂质过氧化的抑制率可达29%。真菌提取物对自由基有一定的清除作用[6]。真菌是自由基清除剂的良好载体。而多糖是真菌中的主要活性成分。

目前，国内外基本上采用水浸法、碱浸法提取多糖，再经有机溶剂沉淀提纯。由于传统工艺采用碱浸、有机溶剂分离提纯等手段，易对灵芝多糖聚合体造成破坏，也易造成某些活性基团变性失活，且粗多糖提取效率极低。膜分离技术是近年来发展起来的在分子水平上实现机械分离的高新技术，由于其具有常温操作、无相态变化、高效节能、无污染等特点，且整个分离过程在密闭系统中进行，可避免和减轻热和氧对物料营养成分的破坏，因此，被认为是21世纪最有前途的技术。采用膜技术进行灵芝多糖的分离纯化，不仅收率高而且极少破坏灵芝多糖结构[7]。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

灵芝，天津市林业果树研究所。

邻苯三酚、番红花T、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等，均为分析纯。

恒温水浴箱，752型分光光度计。

1.2 灵芝多糖的提取

(1)水提醇沉工艺

灵芝子实体→粉碎→粗滤→真空浓缩→醇沉→干燥

(2)膜分离工艺

灵芝子实体→粉碎→预煮→粗滤→微滤→超滤→浓缩干燥

1.3 性能测试

1.3.1 还原能力测定(铁氰化钾还原法)

在2.5 mL pH值6.6的磷酸缓冲溶液中加入1 mL样品、2.5 mL 1%铁氰化钾，混合物在50℃恒温条件下加热20 min，急速冷却，加2.5 mL 10%三氯乙酸，3000 r·min-1离心分离，取上层清液2.5 mL，加2.5 mL水，再加0.5 mL 0.1% FeCl3，混合均匀，静置10 min后在波长700 nm下测吸光度A700。A700值越大，则样品的还原能力越强。

1.3.2 对羟自由基(·OH)的清除作用

根据Fenton反应原理，H2O2在Fe2+存在时生成·OH，反应式如下：

·OH可使番红花T褪色，即在520 nm处可测出·OH的生成情况，进而检测出加入样品的抗氧化活性。反应体系终体积4.5 mL，其中含150 mmol·L-1硫酸钠盐缓冲溶液(pH值7.4)、114 μmol·L-1番红花T、1.927 mmol·L-1EDTA·Na2、1.0 mmol·L-1硫酸亚铁、3% H2O2以及不同浓度的样品，在37℃恒温水浴30 min后，加入0.3 mmol·L-1EDTA·Na2终止反应，以缓冲溶液作参比，在520 nm处检测其OD值。空白组以0.1 mL蒸馏水替代样品，对照组以1.5 mL蒸馏水替代样品和EDTA·Na2。按式(1)计算清除率：

(1)

(2)

2 结果与讨论

2.1 灵芝多糖的还原能力测定

铁氰化钾还原法的原理为：

在波长700 nm条件下测定吸光度A700，结果见表1。

表1 灵芝多糖的还原能力

由表1可知，0.10 mg·mL-1灵芝多糖溶液的A700值与水体系A700值相当，说明该浓度(均指加入反应体系的样品起始浓度，下同)下灵芝多糖没有还原能力。随着浓度的增大，A700值也增大，多糖的还原能力在实验浓度范围内有较好的量效关系。以30 μg·mL-1Vc溶液的还原能力作参比，1.00 mg·mL-1多糖溶液的还原能力强于Vc。以相同起始样品浓度比较A700值，灵芝多糖还原能力明显低于Vc的还原能力，但灵芝多糖溶液还原能力的存在说明灵芝多糖具有抗氧化作用的可能性。

2.2 灵芝多糖的清除自由基作用

2.2.1 不同工艺提取的多糖对·OH的清除作用(表2)

表2 不同工艺提取的多糖对·OH的清除作用

由表2可知，随着灵芝多糖浓度的增加，对Fenton反应体系产生的羟自由基的清除率相应增大，且量效关系非常明显。在相同浓度下，膜分离工艺提取的灵芝多糖清除羟自由基的能力强于传统的水提醇沉工艺，IC50分别为1.36 mg·mL-1、1.58 mg·mL-1。

表3 不同工艺提取的多糖对·的清除作用

由表3可知，随着灵芝多糖浓度的增加，对邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子自由基的清除率相应增大，且量效关系非常明显。在相同浓度下，膜分离工艺提取的灵芝多糖清除超氧阴离子自由基的能力强于传统的水提醇沉工艺，IC50分别为2.55 mg·mL-1、2.83 mg·mL-1。

综上所述，膜分离工艺提取的灵芝多糖清除自由基的能力强于传统水提醇沉工艺。这是因为，在灵芝多糖的提取过程中，传统工艺采用了有机溶剂和多次高温处理，使多糖的生物活性受到影响。

3 结论

(1)灵芝多糖浓度在0.10 mg·mL-1时，其A700值与水体系相当，没有还原能力；在1.00 mg·mL-1时，多糖溶液的还原能力强于30 μg·mL-1的Vc溶液；以相同起始样品浓度比较A700值，灵芝多糖还原能力明显低于Vc的还原能力。但灵芝多糖溶液还原能力的存在说明灵芝多糖具有抗氧化作用的可能性。

(2)对不同工艺提取的灵芝多糖的清除自由基能力进行比较，结果表明，膜分离工艺提取的灵芝多糖清除超氧阴离子自由基和羟自由基的能力均较好，并且清除能力和多糖浓度存在明显的正相关量效关系。

[1]李荣芷，何云庆.灵芝抗衰老机理与活性成分灵芝多糖的化学与构效研究[J].北京医科大学学报，1991，23(6)：473-475.

[2]赵国华，陈宗道，李志孝，等.活性多糖的研究进展[J].食品与发酵工业，2001，27(7)：45-48.

[3]游育红，林志彬.灵芝多糖肽的抗氧化作用[J].药学学报，2003，38(2)：85-88.

[4]马礼金，姚汝华.灵芝的药用及食用研究[J].食品与发酵工业，2000，24(1)：62-66.

[5]蔺丽，方能虎，吴旦，等.灵芝的主要生物活性研究概况[J].中国食用菌，2000，21(3)：38-40.

[6]肖建辉，蒋侬辉，梁宗琪，等.食药用真菌多糖研究进展[J].生命的化学，2002，22(2)：148-151.

[7]刘建华，张志军.灵芝多糖提取与应用现状[J].保鲜与加工，2003，3(3)：9-10.