缬沙坦对尼古丁损伤血管内皮依赖性舒张功能的保护作用及机制

罗宏丽 张青碧 肖顺林 王述蓉

吸烟被认为是心血管疾病发生发展的重要危险因素，而尼古丁是烟草中的主要毒性物质。因此，寻找有效的药物来对抗尼古丁的血管损害作用非常必要。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂（ARB）是有效的且耐受性良好的降压药，已被广泛用于防治心血管疾病。笔者前期实验研究表明ACEI能通过清除氧自由基改善尼古丁对血管内皮的损伤[1]。本研究拟探讨ARB缬沙坦对尼古丁诱导的血管内皮功能损害的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）动物。普通级SD大鼠28只，雌雄不拘，体质量220~250 g，购自西安交通大学医学院实验动物中心，动物合格证号：陕动证字08-004。（2）仪器。PowerLab数据记录和分析系统，包括软件Chart 5.0以及硬件8通道桥式放大器（ADInstruments Co，澳大利亚），FT03C®张力换能器（Grass In⁃strument Co.Quincy，Mass,美国）；Myograph®恒温器官浴漕（DMT，丹麦）；YH·YX-11型浮标式氧气吸入器，上海医疗器械厂；XTZ-E型连续变倍体视显微镜，上海光学仪器厂；DH2500型电热恒温培养箱等。（3）试药。尼古丁、氯化乙酰胆碱（ACh）、L-Nω-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、吲哚美辛（Indo）、二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司；缬沙坦购自天大药业有限公司；DMEM培养基为西安华美生物工程公司产品。除吲哚美辛先用DMSO初溶，其余均用Krebs液溶解，所有试剂使用前用Krebs液稀释。

1.2 标本制作 SD大鼠断头处死，迅速取出肠系膜上动脉，浸入冷的Krebs液中，显微镜下剥除外膜脂肪及部分结缔组织，剪成长约1 mm的血管环。Krebs液组成（mmol/L）：NaCl 119、NaHCO315、KCl 4.6、MgCl21.2、NaH2PO41.2、CaCl21.5和葡萄糖5.6。

1.3 实验分组及血管培养 将制备好的血管环放入盛有2 mL DMEM培养基的培养皿中，每个培养皿中放3~4段，并将血管环分为以下7个组。（1）空白对照组（C组）：加入与实验组等体积的0.9%氯化钠注射液。（2）尼古丁组（N组）：加入0.1 mmol/L尼古丁。（3）缬沙坦低、中、高剂量组（V1、V2、V3组）：先分别加入0.1、1、10 μmol/L缬沙坦，再加入0.1 mmol/L尼古丁。（4）L-NAME组（L组）或吲哚美辛组（I组）：先分别加入L-NAME（100 μmol/L）或Indo（10 μmol/L），再加入尼古丁（0.1 mmol/L）和缬沙坦（10 μmol/L）。各组血管环加完药物之后置37℃恒温培养箱，充以95%O2和5%CO2混和气体，培养24 h后取出。配好的DMEM培养基临用前加入L-谷氨酸584 mg/L、青霉素105U/L、链霉素100 mg/L。

1.4 血管张力实验 血 管环培养24 h后取出，检测其张力。实验前，动脉环静息负荷2 mN，每20 min换液1次，稳定1.5 h。然后以K+-Krebs液（含K+60 mmol/L）检验动脉环收缩性，2次收缩幅度相差<10%者用于实验。K+-Krebs液组成为（mmol/L）：NaCl 60、NaHCO315、KCl 63.5、MgCl21.2、NaH2PO41.2、CaCl21.5和葡萄糖5.5。先用1 μmol/L去甲肾上腺素(NE)预收缩，待张力上升并稳定后，加入累积浓度（10-9~10-6mol/L）的乙酰胆碱（ACh）舒张血管，检测内皮功能。以NE诱发的最大稳定收缩幅度为100%，ACh诱发的舒张幅度与NE诱发的最大稳定收缩幅度之比为血管的舒张率。

1.5 统计学处理 运 用SPSS 13.0软件包进行统计分析，计量数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。检验水准为α=0.05。

表1 各组血管舒张率的比较 （n=8，%±s）

表1 各组血管舒张率的比较 （n=8，%±s）

logC为ACh浓度取对数值；**P<0.01

C组N组V1组V2组V3组I组L组F P C∶N N∶V1 N∶V2 N∶V3 V3∶I V3∶L-9 8.25±4.66 1.45±3.15 1.08±0.72 1.84±0.21 4.25±0.57 2.04±0.13 2.12±0.13 10.952**<0.001 0.734 0.718 0.013 0.046 0.054-8.5 19.44±9.28 5.78±4.50 6.23±0.93 9.56±4.03 14.36±1.93 8.53±1.03 7.43±1.03 10.750**<0.001 0.837 0.085<0.001 0.009 0.002-8 36.14±8.35 14.08±8.51 15.67±2.59 23.76±1.59 29.12±2.38 22.97±1.59 18.97±2.04 20.542**<0.001 0.515<0.001<0.001 0.014<0.001-7.5 55.23±11.37 25.70±5.89 28.36±3.05 35.18±4.34 41.02±4.63 34.43±3.72 30.51±2.03 23.896**<0.001 0.359 0.002<0.001 0.026 0.001-7 73.63±10.68 36.09±7.15 40.23±3.21 49.31±5.42 56.37±6.06 50.87±3.97 40.93±3.07 33.993**<0.001 0.186<0.001<0.001 0.081<0.001-6.5 88.11±7.39 48.94±7.31 53.68±5.01 65.75±5.96 73.27±7.75 60.76±5.37 55.32±5.26 35.646**<0.001 0.144<0.001<0.001<0.001<0.001-6 95.62±3.72 58.71±8.56 62.43±6.83 74.81±6.20 85.61±5.04 73.45±6.43 66.75±5.38 35.658**<0.001 0.235<0.001<0.001<0.001<0.001组别logC

2 结果

血管环与尼古丁共同培养24 h后，对ACh产生的最大舒张率显著低于空白对照组（P<0.01），而除V2组logC为-9、-8.5外，中、高剂量的缬沙坦（V2、V3组）能明显降低尼古丁对血管环内皮依赖性舒张反应的抑制（P<0.05或P<0.01）。除L组logC为-9外，与V3组比较，I组和L组均能使缬沙坦的保护作用明显降低，即ACh产生的最大舒张率显著降低，差别均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1。

3 讨论

内皮依赖性血管舒张反应降低是血管内皮功能不全的主要表现，也是动脉粥样硬化早期的特征性改变，而且对动脉粥样硬化的进展及并发症（如血管痉挛、血栓形成）有重要影响。既往研究发现，ARB缬沙坦在平稳降压的同时，能保护血管内皮细胞，改善血管内皮依赖性舒张功能[2]。乙酰胆碱诱导血管内皮释放的内皮依赖性舒张因子主要有一氧化氮（NO）、前列环素（PGI2）和内皮依赖性超极化因子（EDHF）3种。NO和PGI2既是反映内皮细胞功能的重要指标，又是内皮细胞自我抗损伤的内源性保护因子，二者均具有消除氧自由基和抗氧化损伤的功能。

本研究显示缬沙坦能明显对抗尼古丁所诱导的血管内皮依赖性舒张功能的降低，且这一作用可被一氧化氮合酶抑制剂L-NAME和环氧酶抑制剂吲哚美辛所阻断，提示缬沙坦的保护作用与其保护血管内皮释放小分子活性物质NO和PGI2有关，初步说明NO/一氧化氮合酶（NOS）和环氧酶2条途径均参与缬沙坦的血管内皮保护作用。有文献报道，上述2条途径分别由环磷酸鸟苷（cGMP）和环磷酸腺苷（cAMP）介导，同时又存在相互作用[3]。缬沙坦调节这2条信号通路的详细机制尚待进一步研究。本实验仅局限在NO和PGI2途径，EDHF是否参与，或是否还有其他的机制，尚有待于进一步研究。本研究为动物离体实验，今后将进一步前瞻性的开展长期吸烟者的临床研究，使缬沙坦在预防、治疗由吸烟引起的心血管疾病中发挥主要作用。

文献报道，高血压患者和健康志愿者分别单次予以缬沙坦160 mg、80 mg口服，服药后24 h血药浓度分别为457.8 μg/L、1 800 μg/L[4-5]。本实验中所采用缬沙坦的浓度为0.1~10 μmol/L，其中高浓度10 μmol/L远高于人体血药浓度（1 μmol/L），但缬沙坦作用时间短，血管仅培养24 h，并且此浓度也与另外一些离体实验采用的剂量相一致[6-7]，因此本研究中所采用的缬沙坦浓度还是比较合理的。

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