人参皂苷Rb1抗抑郁作用的动物行为学研究

李玉倩，王 芳，陈建国

(1.华中科技大学同济医学院基础医学院 药理学系 湖北 武汉 430030;2.郑州大学药学院 临床药学系河南郑州 450001)

两千多年来，人参在中国一直作为一种传统的补药，人参根也是在世界范围内使用最广的中药之一。作为人参根的重要活性成分之一，人参皂苷Rb1对中枢神经系统发挥着很多药理作用，如中枢兴奋、改善学习记忆、抗疲劳、抗衰老等神经保护作用和增强机体的抗应激能力等［1］，但关于人参皂苷Rb1的抗抑郁作用，目前尚未见相关报导。本文分别以小鼠悬尾实验和强迫游泳实验，大鼠多次给药强迫游泳实验对该药物的抗抑郁作用进行了初步筛选;然后通过连续21d不可预知性慢性刺激构建大鼠中度慢性应激模型(CMS)，观察人参皂苷Rb1的抗抑郁作用，为人参皂苷Rb1今后用于临床抑郁症治疗提供可靠的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性昆明种小鼠，体重(20±2)g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供;雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g，由湖北省实验动物中心提供。实验前1周购进，自由饮食，饲养室温为(23±1)℃，光照周期为12 h/12 h(7:00/19:00)。

1.2 主要药品及试剂 人参皂苷Rb1的纯度大于98%，由吉林大学药物化学教研室提供;盐酸丙咪嗪的纯度大于99%，购自美国Sigma公司。各药品临用时均用0.9%的生理盐水新鲜配制并稀释到所需浓度。

1.3 研究方法

1.3.1 小鼠悬尾实验:昆明种雄性小鼠60只，随机平均分为5组:空白组(生理盐水)，阳性对照组(丙咪嗪，30 mg/kg)，人参皂苷 Rb1低剂量组(1.25 mg/kg)，中剂量组(2.5 mg/kg)，高剂量组(5.0 mg/kg)。腹腔注射给药，给药体积为10 ml/kg。给药30 min后将小鼠尾部距尾端1 cm处用胶布固定于支撑物，使其呈倒挂状态，头部离下方台面约50 cm，头部周围用板隔离，使其不能看到周围事物。观察时间为6 min，并累计记录6 min内的不动时间。房间内保持安静、光线柔和。为保证实验数据的客观性，实验中均采用盲法进行测定。

1.3.2 小鼠强迫游泳实验:昆明种雄性小鼠60只，分组及给药情况同前。给药前每只动物先入水训练15 min，24 h后给药，给药30 min后把小鼠放入高20 cm，水深10 cm，直径14 cm，水温(25±1)℃的玻璃容器中强迫游泳6 min，记录后4 min内累计不动时间。动物头部露出水面，四肢不动或为使自己不下沉所做的细小动作均称为不动。每只动物实验完后均用毛巾擦干，放入温暖的笼中。房间保持安静、光线柔和，实验过程中不动时间的记录在DVR数字监控系统下进行。实验中采用盲法进行测定。

1.3.3 大鼠强迫游泳实验:Wistar雄性大鼠50只，随机平均分为5组:空白组(生理盐水)，阳性对照组(丙咪嗪，30 mg/kg)，人参皂苷Rb1低剂量组(1.25 mg/kg)，中剂量组(2.5 mg/kg)，高剂量组(5.0 mg/kg)。腹腔注射给药，给药体积2 ml/kg。给药前每只动物先入水训练15 min，24 h后开始给药，连续给药7 d。第7天给药30 min后大鼠放入高40 cm，水深24 cm，直径18 cm，水温(25±1)℃的玻璃容器中强迫游泳6 min，记录动物后4 min内的累计不动时间。实验过程中不动潜伏期和不动时间的记录在DVR数字监控系统下进行。实验中采用盲法进行测定。

1.3.4 慢性中度应激模型:参照 Willner的方法［2］，建立21 d不可预知性慢性刺激应激抑郁症模型。Wistar雄性大鼠60只，随机分为6组，每组10只:空白组(生理盐水)，阳性对照组(丙咪嗪，15 mg/kg)，人参皂苷Rb1 低剂量组(1.25 mg/kg)，中剂量组(2.5 mg/kg)，高剂量组(5.0 mg/kg)。腹腔注射给药，给药体积为2 ml/kg。每日刺激前给药1次，连续给药21 d。除空白组大鼠每笼5只外，其它组大鼠均单笼饲养。除空白组外，其它组大鼠每日接受1种刺激。刺激方式经过稍微调整，包括冰水游泳(4℃，5 min)、热应激(45 ℃，5 min)、摇晃(1 次/s，15 min)、夹尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(48 h)、昼夜颠倒、限制(2 h)和电击足底(36 V，10 s/次，1 次/min，30 次)。每种刺激平均给予2～3次，随机安排，使大鼠不能预知下次刺激的种类。实验前1 d和实验开始后每周的固定时间对大鼠进行糖水喜好实验和敞箱实验。①糖水喜好实验:CMS实验中所有大鼠均参与糖水喜好实验，并且实验中均单笼测试。在进行实验前，每个笼子给予两瓶水进行适应性训练，1瓶是清水，另外1瓶是1%的蔗糖水溶液，训练时间是48 h。实验前所有大鼠给予断水断食23 h处理，然后每笼放入以上两种液体，测试时间为1 h。通过称量实验前后瓶的重量来计算糖水饮用量和清水饮用量，并计算糖水消耗率:糖水消耗率=糖水饮用量/(清水饮用量+糖水饮用量)×100%。实验均在每周固定的日子(星期五)和固定的时间(上午9:00～10:00)进行。②敞箱实验:敞箱实验是用来观察动物的自主活动、对新奇环境探测行为的1种实验方法［3］。为评价模型的效果，在CMS实验前1天及CMS实验过程中每周的固定时间对所有动物进行敞箱实验。分组情况见CMS实验，观察指标有:a.水平得分，动物每3只脚进入1格得1分;b.垂直得分，动物前肢同时离地(洗脸等清洁动作除外)得1分。每只动物观察时间均为5 min，完毕后均对敞箱进行彻底清扫以消除气味所带信息对下1只实验动物造成的影响。房间保持安静，实验均在暗室中进行，敞箱上方距离45 cm处挂1个45 W的灯泡。为保证实验数据的客观性，实验中采用盲法进行测定。

1.4 统计学分析 使用Access数据库软件平行双人录入数据，以SAS 9.13统计软件进行单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 人参皂苷Rb1对小鼠悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)的影响 如表1所示，在小鼠悬尾实验和小鼠强迫游泳实验中，同空白组相比，人参皂苷Rb1低、中、高剂量组与阳性对照组的不动时间均明显缩短，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 小鼠TST和FST实验中人参皂苷Rb1作用后不动时间的改变(n=12±s)

表1 小鼠TST和FST实验中人参皂苷Rb1作用后不动时间的改变(n=12±s)

* 与空白对照组相比，P＜0.05，＊＊与空白对照组相比，P＜0.01。

剂量(mg/kg)不动时间(s)TST FST空白组97.33 ±11.40 134.68 ±14.53阳性对照组 31.58±4.45＊＊ 83.77±14.20＊＊1.25 54.56 ±8.03＊＊ 122.60 ±20.34*2.50 49.74 ±6.04＊＊ 114.08 ±17.02＊＊5.00 36.23 ±5.04＊＊ 95.83 ±10.65＊＊

2.2 人参皂苷Rb1对大鼠强迫游泳实验的影响 如表2所示，在大鼠强迫游泳实验中，同空白组相比，人参皂苷Rb1低、中、高剂量组与阳性对照组均显著缩短大鼠不动时间，并延长开始出现不动状态的潜伏期，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表2 大鼠FST实验中人参皂Rb1作用后不动时间及不动潜伏期的改变(n=10±s)

表2 大鼠FST实验中人参皂Rb1作用后不动时间及不动潜伏期的改变(n=10±s)

* 与空白对照组相比，P ＜0.05，＊＊与空白对照组相比，P ＜0.01。

剂量(mg/kg)不动时间(s)潜伏期(s)104.00 ±11.00 24.60 ±5.53阳性对照组 42.11±5.58＊＊ 131.56±26.50＊＊1.25 72.70 ±8.27* 50.80 ±8.10*2.50 65.40 ±8.85* 66.10 ±10.01*5.00 47.00 ±6.36＊＊ 69.43 ±8.31空白组*

2.3 人参皂苷Rb1对大鼠敞箱实验的影响 表3显示，CMS逐渐降低了动物的自主活动，表现为第2周和第3周的水平得分显著降低，同正常组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在第3周，中剂量和高剂量的人参皂苷Rb1显示出对这种降低的减缓作用，同CMS组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。表4显示，CMS逐渐降低了动物对新奇环境的探测行为，从第1周开始显著降低了动物的垂直得分，同正常组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。从第2周开始，高剂量的人参皂苷Rb1显示出对这种降低的减缓作用，而中剂量则在第3周末显示出这种作用，同CMS组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。低剂量的人参皂苷Rb1在敞箱实验中没显示出对CMS所致的行为学改变具有改善作用。阳性对照药丙咪嗪从第2周开始显示出了抗CMS诱导的行为学改变作用，同CMS组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表3 敞箱实验中人参皂苷Rb1逆转了CMS诱导的大鼠水平得分的降低(n=10，±s)

表3 敞箱实验中人参皂苷Rb1逆转了CMS诱导的大鼠水平得分的降低(n=10，±s)

#与空白对照组相比，P＜0.05，##与空白对照组相比，P＜0.01;*与CMS模型组相比P＜0.05，＊＊与CMS模型组相比P＜0.01。

组别 剂量(mg/kg)水平得分实验前 1周 2周 3周空白对照组 0 47.20 ±8.23 44.00 ±8.24 44.10 ±8.11 42.70 ±6.＊＊03 CMS 模型组 0 44.80 ±5.68 34.40 ±8.65 29.20 ±5.26# 25.70 ±5.83##阳性对照组 15 42.00 ±6.29 39.30 ±6.34 39.00 ±6.66 39.40 ±7.36＊＊低剂量组 1.25 47.00 ±7.65 36.20 ±7.89 34.40 ±7.35 33.60 ±6.36中剂量组 2.50 46.00 ±8.26 38.70 ±8.94 37.60 ±9.65 36.00 ±8.97*高剂量组 5.00 46.40 ±5.54 39.30 ±7.78 39.60 ±6.96 38.90 ±7.18

表4 敞箱实验中人参皂苷Rb1逆转了CMS诱导的大鼠垂直得分的降低(n=10，s)

表4 敞箱实验中人参皂苷Rb1逆转了CMS诱导的大鼠垂直得分的降低(n=10，s)

#与空白对照组相比，P＜0.05，##与空白对照组相比，P＜0.01;* 与 CMS模型组相比 P＜0.05，＊＊与 CMS模型组相比 P＜0.01。

组别 剂量(mg/kg)水平得分实验前 1周 2周 3周空白对照组 0 10.40 ±2.00 10.90 ±2.12 10.10 ±2.15 9.90 ±1.63 CMS 模型组 0 9.60 ±1.70 7.70 ±1.56# 6.10 ±1.70## 5.10 ±1.57##阳性对照组 15 10.20 ±1.62 9.50 ±2.71 9.40 ±2.00* 9.20 ±1.82＊＊低剂量组 1.25 10.60 ±1.72 8.40 ±1.34 7.90 ±1.38 7.20 ±1.82中剂量组 2.50 9.80 ±2.33 8.80 ±1.90 8.80 ±1.97 8.60 ±1.69*高剂量组 5.00 10.00 ±1.59 9.30 ±2.30 9.20 ±1.39* 9.10 ±1.11＊＊

2.4 人参皂苷Rb1对糖水喜好实验中糖水消耗率的影响 表5显示，CMS从第2周开始显著降低了动物的糖水消耗率，从71.78%下降到46.32%，同正常组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。中、高剂量的人参皂苷Rb1从第2周开始显著逆转了CMS诱导的动物糖水消耗率的降低，同CMS组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而低剂量的人参皂苷Rb1在第3周才显现出这种效应。阳性对照药丙咪嗪同人参皂苷Rb1具有相似的作用。

表5 糖水喜爱实验中人参皂苷Rb1逆转了CMS诱导的大鼠糖水消耗率的降低(n=10，s)

表5 糖水喜爱实验中人参皂苷Rb1逆转了CMS诱导的大鼠糖水消耗率的降低(n=10，s)

##与空白对照组相比，P＜0.01;*与CMS模型组相比P＜0.05，＊＊与CMS模型组相比P＜0.01。

组别 剂量(mg/kg)糖水消耗率%实验前 1周 2周 3周06 CMS 模型组 0 71.78 ±6.43 52.17 ±7.40 47.56 ±7.75## 46.32 ±7.36##阳性对照组 15 73.59 ±4.40 62.58±7.90 67.46±5.15＊＊ 69.19±4.60＊＊低剂量组 1.25 70.98 ±5.83 53.46 ±5.46 58.45 ±5.19 60.41 ±7.56*中剂量组 2.50 72.25 ±7.33 54.86 ±9.56 61.96 ±11.56* 62.87 ±6.14＊＊高剂量组 5.00 71.32 ±4.38 56.76 ±8.17 63.71 ±6.87* 65.64 ±6.88空白对照组 0 71.10 ±7.11 63.51 ±6.45 66.74 ±6.40 67.38 ±6.＊＊

3 讨论

通过一系列动物抑郁模型实验发现:1.25 mg/kg、2.5 mg/kg和5.0 mg/kg 3种剂量的人参皂苷Rb1可以剂量依赖性地降低动物的不动时间，并且连续给药21 d可以逆转不可预测性的中度慢性应激诱导的一些行为学的改变。这些结果同阳性对照药物丙咪嗪相似，显示了人参皂苷Rb1具有抗抑郁的作用。

强迫游泳实验和悬尾实验是目前被广泛应用的两种动物抑郁模型实验，反映出一种被称之为行为绝望(behavioral despair，BD)状态［4，5］，不动状态持续的时间即不动时间被用来评价抑郁的程度。大量研究显示，啮齿类动物给予抗抑郁症药物处理后，可降低不动时间。这种行为绝望模型被广泛用于抗抑郁药物的初筛和药理学评价实验。但这两个模型是非特异性的抑郁模型，结合敞箱实验则可有效排除假阳性现象。在本实验中，小鼠悬尾实验和强迫游泳实验为急性实验，单次给药30 min后开始测定指标，结果显示，3种剂量的人参皂苷Rb1剂量依赖性地降低了不动时间。

在大鼠强迫游泳试验中，考虑到动物种系的差异，并且有文献报道，强迫游泳实验中动物对抗抑郁剂的处理可能有一个亚慢性的反应［6］，因此本实验在原来单次给药的基础上又连续给药6 d，采取了亚慢性的给药方法，结果显示，人参皂苷Rb1呈剂量依赖性的降低了不动时间，延长了大鼠出现绝望状态的潜伏期，与阳性对照药物丙咪嗪具有相似的作用，据此可以推测人参皂苷Rb1可能具有抗抑郁的作用。

慢性中度应激(CMS)模型是模仿人类而设计的。当给予动物几周不可预测性的应激原时，动物将会显示一系列的行为学方面的改变，包括喜好、自主活动及探测行为的改变等等。在CMS诱导的这些行为学改变中，动物糖水消耗的降低被认为是一项非常可靠的行为学测定方法，因为它与抑郁症患者所表现出的快感缺失症状非常相似。大量研究显示，三环类抗抑郁药或5-羟色胺再摄取抑制剂均可以逆转CMS诱导的动物糖水消耗的降低［7］。本次实验结果显示，经过3周的连续给药后，3种剂量的人参皂苷Rb1逆转了CMS诱导的糖水消耗的降低，呈现出抗抑郁的作用。

敞箱实验中的行为评定是检测动物的自主活动能力以及对新奇环境的探究行为。但一些具有中枢兴奋性的药物在抗抑郁症的动物行为学实验中同样可以产生类似于抗抑郁的作用，产生假阳性的结果。在所有实验前我们做了一次敞箱实验，发现人参皂苷Rb1在实验所用的剂量下没有中枢兴奋作用，排除了假阳性的可能，保证了后续实验中数据的可靠性。在21 d的不可预测性慢性中度应激模型中我们发现，随着用药时间的增加，2.5 mg/kg和5.0 mg/kg两个剂量的人参皂苷Rb1可以逆转CMS诱导的水平和垂直得分的降低，低剂量虽然没有显著作用，仍能看出有这种趋势，提示了该药物具有抗抑郁的作用。

总的来说，一系列动物抑郁模型实验结果显示，人参皂苷Rb1在行为学上具有抗抑郁作用，为今后抗抑郁症药物的开发及其抗抑郁作用机制的探索提供了一定的实验依据。

［1］贾继明，王宗全，吴立军，等.人参皂苷Rb1的药理活性研究进展［J］.中国中药杂志.2008，33(12):1371-1377.

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［3］Pistovcakova J，Dostalek M，Jezova D，et al.Tiagabine treatment is associated with neurochemical，immune and behavioural alterations in the olfactory bulbectomized rat model of depression［J］.Pharmacopsychia，2008，41(2):54-59.

［4］Eissa Ahmed AA，Al-Rasheed NM，Al－Rasheed NM.Antidepressant-like effects of rosiglitazone，a PPARγ agonist，in the rat forced swim and mouse tail suspension tests［J］.Behav Pharmacol，2009，20(7):635-642.

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［6］Dulawa SC，Holick KA，Hen R，et al.Effects of chronic fluoxetine in animal models of anxiety and depression［J］.Neuropsychopharmacol，2004，29(7):1321-1330.

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