NF-κB decoy寡核苷酸对人结肠癌细胞株SW480/ADM耐药性的逆转作用

刘 昕

(中国人民解放军第316医院，北京100093)

许多研究已经证实，核转录因子κB(NF-κB)与多种疾病相关，是多种信号转导途径的汇聚点。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是导致肿瘤化疗失败的主要原因，也是亟待解决的临床难题之一。2010年8月～2011年1月，我们就NF-κB decoy寡核苷酸对结肠癌细胞株的耐药性逆转进行了研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 人结肠癌细胞耐药株SW480/阿霉素(ADM)系本实验室储存。RPMI 1640培养液购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自GIBCO公司，MTT、DMSO及ECL发光试剂盒购自美国Sigma公司，NF-κB P65抗体及羊抗兔二抗均购自碧云天公司。ADM为日本明治医药公司产品;NF-κB decoy ODNs序列为 5＇-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3＇和 3＇-GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5＇，由上海生工合成;Liperfection2000购自invitrigen公司。

1.2 细胞培养及分组 SW480贴壁生长于完全培养基(RPMI1640中含10%小牛血清，青霉素和链霉素各50 U/L)中，SW480/ADM于完全培养基中加入0.5 mg/L ADM，并定期添加1 mg/L ADM以维持其耐药性，两种细胞均于37℃、5%CO2的饱和湿度箱中培养，隔天换液，对数生长期传代。细胞分为对照组、SW480组、SW480/ADM组。将各组细胞按3 000个/孔种入96孔板，常规培养，于12、24、48 h时取出。检测时加入MTT 50μl(1 mg/ml)，培养4 h后，吸去培养液，加入100μl二甲基亚砜，脱色摇床20 min摇匀，在570 nm波长检测吸光度A值，并计算细胞的半抑制浓度IC50。

1.3 Western blot检测核内 NF-κB 48 h 后，收集各组细胞，提取细胞核蛋白，SDS-PAGE胶分离，湿法转膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗(1∶2 500)4℃过夜，TBST漂洗3次后二抗(兔抗羊，1∶2 000)37℃孵育2 h，TBST漂洗后ECL发光。

1.4 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件;计量资料以±s表示，行单因素方差分析;计数资料采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-κB decoy的有效性验证 免疫细胞化学发现NF-κB decoy处理的SW480/ADM细胞核内染色较对照组明显降低，提示活化 NF-κB减少，与SW480/ADM组相比有统计学差异(P＜0.01)。Western blot同样证实，经过NF-κB decoy处理后，核蛋白内 NF-κB 明显减少(P ＜0.01)。证明 NF-κB decoy干预有效。

2.2 NF-κB decoy 逆转细胞株耐药性 按文献［1］将NF-κB decoy质粒转入细胞后，利用MTT检测细胞存活率。结果提示，转染不同质量(浓度)NF-κB decoy质粒后48 h，SW480/ADM的IC50值呈剂量依赖性下降(P＜0.05)。见表1。选取转染 NF-κB decoy质粒终浓度为 1 μmol/L，在 12、24、48 h 进行检测，结果提示随着时间延长，自24 h起，NF-κB decoy对耐药细胞株的逆转作用与对照组有统计学差异(P ＜0.05)。见图1。

表1 不同浓度NF-κB decoy质粒对48 h两种细胞株的ADM 敏感度(IC50，±s)

表1 不同浓度NF-κB decoy质粒对48 h两种细胞株的ADM 敏感度(IC50，±s)

mol/L SW480组组别 0 μmol/L 0.1 μmol/L 0.3 μmol/L 1 μ 8.0 ±0.2 7.8 ±2.5 7.1 ±0.9 7.0 ±0.3 SW480/ADM组43.7 ±9.8 37.7 ±6.7 12.2 ±3.9 8.1 ±0.8

图1 NF-κB decoy不同时间对SW 480/ADM的耐药性逆转情况

3 讨论

耐药性又称抗药性，系指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于药物作用的耐受性，主要是经长期或反复用药后特别是滥用药物后产生。耐药性一旦产生，药物的治疗作用就明显下降或消失。因此，研究结肠癌耐药的相关分子生物学机制，寻找逆转结肠癌化疗耐药的新方法，已经成为目前结肠癌治疗领域的研究重点之一。NF-κB存在于体内多种细胞中，活化后能与许多基因启动子区域的固定核苷酸序列结合而启动基因转录，参与多种疾病的发病过程，不仅与细胞的增殖、凋亡、生长分化、细胞周期及机体的免疫应答状态有关，而且还与肿瘤的发生、发展和浸润转移有密切关系［2～4］。在肿瘤耐药方面，目前的研究资料认为，NF-κB活化后可上调肿瘤细胞存活基因的转录，使肿瘤细胞逃避化疗药物所引起的死亡效应，从而诱导肿瘤耐药。NF-κB活性升高是导致结肠癌HT-29细胞多细胞耐药的重要原因之一，李建军等［2］的实验结果提示其机制可能与凋亡相关蛋白的表达调控有关。

由于NF-κB能特异性识别并结合目的基因上的κB序列，利用这个特性，可合成包含κB序列的双链ODNs，将其转入靶细胞核，可竞争性结合核内激活的NF-κB，使 NF-κB不能发挥作用，这一策略也被称为decoy。NF-κB decoy寡核苷酸已经在心血管疾病、炎症性疾病、器官移植和肿瘤［3，4］的治疗研究中都取得了令人满意的结果。与使用NF-κB抑制剂如IKKs或IKBs等比较，NF-κB decoy寡核苷酸靶向性更加明确，抑制效果更加专一。本研究采用NF-κB decoy方法使 NF-κB不能发挥作用，可有效逆转结肠癌细胞株对ADM的耐药性。但是值得注意的是，由于NF-κB涉及到多个信号途径，对肿瘤细胞耐药性的作用仅为其生理功能的一方面，是否有其他方面的影响尚待下一步实验继续验证。

［1］Yoshizumi T，Ikeda Y，Kanedaand Y.Ex vivo transfer of nuclear factor-κB decoy ameliorates hepatic cold ischemia/reperfusion injury［J］.Transplantation Proceedings，2009，41(5):1504-1507.

［2］李建军，潘凤，黄海辉，等.NF-κB信号通路介导结肠癌多胞耐药的作用研究［J］.解放军医学杂志，2008，33(10):1205-1208.

［3］De Stefano D，De Rosa G，Carnuccio R.NF-kappa B decoy oligonucleotides［J］.Curr Opin Mol Ther，2010，12(2):203-213.

［4］Fichtner FS，Fuss IJ，Preiss JC，et al.Treatment ofmurine Th1-and Th2-mediated inflammatory bowel disease with NF-kappa B decoy oligonucleotides［J］.J Clin Invest，2005，115(11):3057-3071.