高效液相色谱法同时检测染发剂中3种二氨基酚类物质

曹 鹏 李金强 梁君妮 沙美兰 关丽丽 牟妍

(1.烟台出入境检验检疫局 山东烟台 264000;2.山东农业大学食品学院)

1 前言

二氨基酚类作为广泛使用的精细化工中间体，主要应用于医药、染料、橡胶、石油、农药等行业。它是一种危害严重的化合物，可诱导DNA断裂而具有遗传毒性，即使在很低的浓度下也可产生基因突变，具有致癌性，且很难自然降解。

氧化型染发剂(又称持久性染发剂)以其染色效果好、色调变化宽、维持时间长等诸多优点而成为最受欢迎的染发剂，在欧洲和美国约占到市场分额的80%，其主要由氧化型染料和氧化剂组成，使用前混匀，在头发中发生化学反应而产生颜色。作为氧化型染料，2，4－二氨基苯酚及其盐和2，3－二氨基苯酚被用于氧化型染发剂中，欧盟和我国都规定了其最大使用浓度不得超过10%;而2，4－二氨基苯甲醚及其盐，因其具有致敏性和致癌性，会对人体健康造成多种急性或慢性的损害，所以被欧盟和中国列为禁用物质［1－4］。

目前，关于染发剂中氧化型染料的测定方法，应用最多的是液相色谱法［5－10］和气相色谱－质谱法［11－14］，此外还有应用气相色谱法［15，16］、液相色谱－质谱法［17，18］的报道，主要是围绕染发剂中的苯二胺类及某些酚类化合物进行测定，而有关二氨基酚类化合物的检测较少。

本研究采用添加抗氧化剂的甲酸水溶液提取样品，正己烷净化，经过高效液相色谱(HPLC)分离后，采用紫外检测器对样品中2，4－二氨基苯酚盐酸盐、2，3－二氨基苯酚和2，4－二氨基苯甲醚盐酸盐进行检测，建立了染发剂中3种二氨基酚类化合物同时提取、同时检测的高效液相色谱定性、定量方法。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试剂和材料

除另有规定外，试剂均为液相色谱纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

甲醇、乙腈、甲酸、正己烷、抗坏血酸：均为优级纯;

庚烷磺酸钠、柠檬酸：分析纯;

2，4 －二氨基苯酚盐酸盐(≥99.0%)，2，4 －二氨基苯甲醚盐酸盐(≥99.0%)，2，3－二氨基苯酚(≥97.0%)，均为 Dr.Ehrenstorfer公司产品。

0.2%庚烷磺酸钠水溶液(PH=3)：称取2.0 g庚烷磺酸钠，用水溶解并定容至1000 mL，柠檬酸调节PH值=3;

0.1%甲酸甲醇溶液：称取0.2 g抗坏血酸，加入1 mL甲酸，用甲醇定容至1 L;

0.1%甲酸水溶液：称取0.2 g抗坏血酸，加入1 mL甲酸，用水定容至1 L;

标准储备溶液：精确称取适量标准品(精确至0.1mg)于50mL棕色容量瓶中，以0.1%甲酸甲醇溶液定容至刻度;2，3－二氨基苯酚需采用差量法称取5mg溶解，储备液保存于4℃冰箱中，1周内使用;

标准工作溶液：根据需要移取适量标准储备溶液至棕色容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液稀释成适用浓度的标准工作溶液，现配现用。

2.1.2 仪器和设备

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，配有紫外－可见检测器或二极管阵列检测器(美国);超纯水仪：Milli－Q Gradient(法国);高速离心机：TGL－10C(上海安亭科学仪器厂);超声波提取仪：KQ－600E(昆山市超声仪器有限公司);漩涡混合器：FJ200－S(上海标本模型厂)。

2.2 方法

2.2.1 样品的前处理

称取0.010 g试样(精确至0.0001 g)于10 mL离心管中，迅速加入5 mL0.1%甲酸水提取液及5 mL正己烷，涡旋1 min，超声5 min，再涡旋1 min，5000 r/min离心5 min，弃去上层;再次加入5 mL正己烷，涡旋1 min，5000 r/min离心1 min，吸取下层水相过0.22 μm滤膜，供液相色谱测定。

2.2.2 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C8(4.6 mm ×250 mm，5μm);流速：1.0 mL/min;进样体积：20 μL;柱温：30℃;检测波长：286nm;流动相：A 为0.2%庚烷磺酸钠水溶液(柠檬酸调PH=3)，B为乙腈，C为甲醇;梯度洗脱程序见表1。

3 结果与分析

3.1 标准品的配制

二氨基酚类曝露在空气中很容易被氧化，所以在配制标准品的过程中应添加适合的抗氧化剂。由于后期检测需用紫外检测器，因此选择分子量小、对紫外检测器无干扰的抗坏血酸作为抗氧化剂。

3.2 样品提取和净化条件的选择

因二氨基酚类分子极性较强，易溶于水，降低提取液PH值可以增加其在水相的溶解度，减少在有机相中的分配比，同时提取液中添加一定的抗坏血酸作为抗氧化剂，也不会对色谱造成损害和污染。因此，最终采用含0.1%甲酸、0.02%抗坏血酸(L－Ascorbic acid)的去离子水作为提取溶液。

氧化型染发剂一般为二剂型，其中着色剂基本处于不稳定状态，在遇热、水介质、暴露空气等情况下均易氧化，变质失效，导致实际检测值与样品中的含量不符合。因此，产品配方中均含有辅加剂，主要由稳定剂(抗氧化剂)、表面活性剂、pH调节剂以及高碳醇等组成，且大部分辅加剂可在正己烷－水相萃取体系中形成乳化层而去掉。由图1可以看出，净化效果完全可以满足液相色谱的检测需求。

图1 样品净化前后的液相色谱图

3.3 色谱柱和流动相的选择

3种物质中除了2，4－二氨基苯甲醚盐酸盐，其它2种在苯环上带有氨基和羟基，属于两性物质，极性较强、挥发性低，且检测时受基质影响严重。由于其难以被普通反相柱保留，因此，在建立液相分离条件时比较了ZORBAX Eclipse Plus C8(4.6 mm ID ×250 mm，5 um)、ZORBAX Eclipse XDB －C18(4.6 mm ID ×250 mm，5 um)、LiChrospher 100 NH2(4.6 mm ID ×250 mm，5um)、Synergi MAX －RP 80A(4.6 mm ID ×250 mm，4 um)，观察4种色谱柱对目标化合物的分离效果。结果发现，采用ZORBAX E-clipse Plus C8色谱柱，3种物质得到了基线分离，而且峰形得到了很大的改善。

为了优化流动相，使用了乙腈+水、甲醇+水、乙腈+0.1%甲酸水、甲醇+0.1%甲酸水，结果发现色谱峰分离度较差，拖尾比较严重，这是因为二氨基酚类在水中解离后呈弱碱性，在反相柱上可与未封端的硅醇基相互作用，导致峰型拖尾;使用强酸性的离子对试剂与其作用生成带烷基链的中性分子，可增加其在反相柱上的保留并改善峰性;最后使用甲醇+乙腈+庚烷磺酸钠/柠檬酸水溶液时(比例见表1)，得到了较好的分离度和色谱峰。

选择上述色谱柱和流动相进行分析，典型的液相色谱图见图2。

图2 3种二氨基酚类混合标准品色谱图

3.4 方法的线性范围与检出限

称取3种二氨基酚类物质的标准储备液，并用空白基质溶液稀释成 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列工作溶液，以本标准的测试条件，每次进样20 μL进行测定。以质量浓度(mg/L)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，结果表明各组分皆能保持良好的线性关系。以S/N=3所对应的被测化合物的含量作为方法的检出限(LOD)，以S/N=10所对应的被测化合物的含量作为方法的定量下限(LOQ)，结果见表2。

表2 3种二氨基酚类化合物的线性方程、检出限、定量下限

3.5 回收率与精密度

以不含二氨基酚类化合物的氧化型染发剂为研究对象，分别加入不同浓度的混合标样，每组做6个平行样品，进行回收率和精密度实验。结果(见表3)显示，目标化合物的回收率为76.0% －109.8%，RSD为0.8% －7.9%，说明方法精密度良好，符合残留分析的要求。空白染发剂样品色谱图和添加量为100 mg/kg的染发剂样品色谱图见图3、图4。

表3 方法的加标回收率、相对标准偏差

图3 空白样品的高效液相色谱图

图4 加标样品的高效液相色谱图

4 结论

本实验采用高效液相色谱仪，建立了染发剂中3种二氨基酚类化合物残留检测方法。在所选的实验条件下，3种化合物用ZORBAX Eclipse Plus C8色谱柱分离后，采用二极管阵列检测器进行定性及定量分析。方法具有灵敏度高，准确度和精密度好的特点，适合于染发剂中二氨基酚类化合物的检测。

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