经前三剂止痛方治疗痛经活性部位的筛选*

2011-07-14孙绪美姜国云赖晓艺范同梅

天津中医药大学学报 2011年4期

孙绪美，姜国云，赖晓艺，范同梅，方玲

300251天津市河西区妇产科医院（范同梅）

痛经是妇女常见病，发病率高且严重影响妇女健康和工作效率。痛经的发病原因较复杂，其发病机制还不完全清楚。研究表明，其形成主要涉及以下因素：与月经的周期性生理变化相关，痛经多发生在黄体期和月经初期，说明此期机体内环境的改变是痛经形成基础；与子宫内膜、子宫平滑肌细胞和子宫壁螺旋动脉等病理改变相关；与内分泌因素改变相关，在痛经形成过程中，前列腺素、血管加压素、催产素、雌激素、孕激素、内皮素、一氧化氮、β-内啡肽、钙（Ca2＋）和氧自由基等的合成和分泌发生改变，它们与不同的靶点结合，通过不同的途径，促使痛经形成。其中前列腺素在痛经形成中起重要作用，而血管加压素、催产素、雌激素和孕激素可通过促进前列腺素的合成和分泌，形成痛经。内皮素、一氧化氮和β-内啡肽等受雌激素和血管损伤的影响，进一步加重血管损伤和疼痛症状。细胞内钙离子超载和组织中氧自由基的生成也受血管损伤的影响，其又进一步加重血管的损伤，由此构成了复杂的痛经损伤发生机制。

本实验在前期研究基础上[1-3]，对经前三剂止痛方（JQF）进行分离提取，获得了4个提取部位，即JQF-A-E、JQF-A-N-30、JQF-W、JQF-A-W-W 并采用小鼠痛经模型扭体实验，二甲苯致炎实验，热刺激实验和大鼠离体子宫平滑肌收缩实验对它们进行了活性筛选，进而在整体痛经模型和离体子宫平滑肌模型上对筛选获得活性部位治疗痛经的作用及其可能的作用机制进行了实验研究。

1 材料和方法

1.1 药品、试剂、实验动物和器材 JQF和JQF-AE、JQF-A-N-30、JQF-W、JQF-A-W-W 由天津中医药大学药物化学实验室制备。JQF（当归、川芎、赤芍、益母草、桂枝、蒲黄、五灵脂、白术、茯苓）,购自天津中医药大学保康医院，并经生药学鉴定。

前列腺素 F2α（PGF2α），Sigma公司；乙酰胆碱（Ach）（批号060517），北京化学试剂公司；缩宫素注射液（10 U，1 mL，批号 040912），上海第一生化药业有限公司；己烯雌酚注射液（0.5 mg，1 mL，批号0806021），天津金耀氨基酸有限公司。阿司匹林肠溶片（25 m/片，批号：20070501），印尼拜耳公司制造；二甲苯、生理盐水，中国大冢制药有限公司；台式液[NaCl 8.0g、10%KCl2.0 mL（0.2g）、10%MgSO4·7H2O 2.6 mL （0.26g）、5%NaH2PO4·2H2O 1.3 mL（0.065g）、NaHCO31.0g、1 mol/L CaCl21.8 mL（0.2g）、葡萄糖1.0g，蒸馏水加至1 000 mL]。

雌性KM小鼠22～26g，雌性SD大鼠，240～280g，购自天津中医药大学动物房[合格证号：SCXK（京）2007-0001]；RM6240B/C生物信号采集理系统2.0j版，肌肉张力换能器（JZ101型，0～5g），恒温槽（WC/09-05），麦氏浴槽，光测痛仪，打孔器。

1.2 JQF有效部位提取[4]

1.2.1 JQF的制备按配方取各味生药，粉碎后用5倍95%乙醇加热回流提取2次，过滤后合并95%乙醇提取液，将乙醇提取液浓缩至无醇味；药渣中加入5倍体积的水，加热回流提取2次过滤，将95%乙醇提取液与水提液合并，浓缩至1 kg（生药）/L，出膏率为24.75%

1.2.2 JQF-A-N-30的制备上述配方取各味生药，粉碎后用水煎煮3次，每次2 h。滤液合并后浓缩并进行大孔树脂柱层析分离，依次以水、30%乙醇洗脱，30%乙醇洗脱部位经浓缩，冷冻干燥，出膏率为1.98%。

1.2.3 JQF-A-E的制备按上述配方取各味生药，粉碎后用95%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，过滤后合并95%乙醇提取液，将乙醇提取液浓缩至无醇味，得乙醇提物JQF-A。将此醇提物经乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，出膏率为2.77%。

1.2.4 JQF-A-W-W的制备按上述配方取各味生药，粉碎后用95%乙醇加热回流提取2次，每次2 h过滤后合并95%乙醇提取液，将乙醇提取液浓缩至无醇味，得乙醇提物JQF-A。该醇提物经乙酸乙酯和正丁醇萃取后的水相部位经大孔吸附树脂分离，以水、30%乙醇洗脱，水洗脱部位经浓缩，冷冻干燥，出膏率为5.42%。

1.2.5 JQF-W制备按上述配方取各味生药，粉碎后用95%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，过滤。药渣用水加热回流提取2次，每次2 h，将水提液过滤、适当浓缩，冷冻干燥为JQF-W，出膏率为6.07%。

1.3 小鼠镇痛实验

1.3.1 JQF提取物对热刺激致小鼠疼痛实验的影响取雌性KM小鼠70只，使用智能热板仪重复测定小鼠正常痛阈值2次，选取基础痛阈在5～10秒之间的小鼠，取2次痛阈平均值作为该鼠给药前的基础痛阈值。按照随机数字表法将动物分为正常对照组、阿司匹林组，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、JQF-A-W-W、JQF-W组，每组10只，每天灌胃给药（0.02 mL/g），连续 3 d，对照组给予等容积蒸馏水。于末次给药后30、60、120 min分别测小鼠痛阈值计算痛阈提高百分率，比较组间差异。如60秒仍无反应，将小鼠取出，以免烫伤，其痛阈值以60秒计算。

痛阈提高百分率=（药后痛阈-基础痛阈）/基础痛阈×100%

1.3.2 小鼠痛经模型扭体实验取雌性KM小鼠，18～22g，70只每日皮下注射己烯雌酚每只0.2 mg，连续3 d第4天实验前禁食不禁水12～16 h，实验时按体质量随机分正常对照组、阿司匹林组、JQF、JQF-A-E、JQF-A-N-30、JQF-A-W-W、JQF-W 组，灌胃给相应药物（0.02 mL/g），正常组、模型组给等体积的生理盐水，给药40 min后腹腔注射（2×103U/L）催产素生理盐水溶液0.01 mL/g，注射缩宫素5 min后用录像机拍摄记录扭体次数，连续拍摄30 min，计算该时间段内扭体次数。

1.4 小鼠抗炎实验取KM小鼠70只，雌性，体质量18～22g，随机分为正常对照组、阿司匹林组、JQF、JQF-A-E、JQF-A-N-30、JQF-A-W-W、JQF-W组，每组10只。灌胃给药（0.02 mL/g），每天l次，连续3 d，空白对照组给予等容积蒸馏水。末次给药1 h后将二甲苯100 μL均匀滴于小鼠右耳两面，左耳不涂作为对照。60 min后将小鼠脱颈椎处死，用直径8 mm打孔器分别在左、右耳同一部位打下圆耳片，秤质量，以左、右耳片质量之差作为肿胀度，比较各组间差异。

1.5 大鼠离体子宫平滑肌实验取雌性SD大鼠体质量180～220g，皮下注射己烯雌酚2 mg/kg，以增加子宫平滑肌条对药物的敏感性。24 h后将大鼠颈脱臼处死，迅速剖取子宫，两个子宫角各取2 cm的子宫段，将其悬挂于充满台氏液的麦氏浴槽中，一端固定在浴内T形钩上，一端与肌肉张力换能器连接，恒温37℃、饱和氧气孵育，肌肉张力换能器通过计算机软件RM6240B/C生物信号采集理系统2.0j版，记录肌条的收缩情况[5]。

待子宫收缩稳定后，先记录5～10 min正常收缩曲线，随后加入台氏液中，分别给药，缩宫素（终浓度10 U/L）、ACh（终浓度10 μmol/L）、PGF2α（终浓度 1 mg/L）、KCL（终浓度 60 mmol/L）刺激子宫收缩10 min后，再分别加入受试药物加入JQF（终浓度10 000 mg/L）、JQF-A-N-30（终浓度 160 mg/L）JQFA-E（终浓度 200 mg/L）、JQF-A-W-W（终浓度 200、400、600 mg/L）、JQF-W（终浓度 240、480、960 mg/L）阿司匹林（终浓度16 mg/L），记录给药后子宫收缩频率，幅度，观察药物对子宫痉挛性收缩的对抗作用，记录20 min，用营养液冲洗3次后，进行下一次实验观察。用RM6240C型多道生理信号采集处理系统采集处理数据，并求出子宫收缩曲线下面积（AUC）。

1.6 数据处理用SPSS 18.0软件包分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态分布的计量资料组间比较采用单因素方差分析，偏态分布的计量资料组间比较采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 对热刺激小鼠疼痛的影响结果提示，药后30 min，阿司匹林组小鼠痛阈提高百分率与正常对照组比较具有统计学差异（P＜0.01）；药后 60 min，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E和阿司匹林组小鼠痛阈提高百分率与正常对照组比较具有统计学差异（P＜0.01），JQF-A-W-W组小鼠痛阈提高百分率亦具有统计学差异(P<0.01)；药后 120 min，JQF、JQF－A－N－30、JQF－A－E和阿司匹林组痛阈提高百分率，与正常对照组比较具有统计学差异（P＜0.01），JQF－A－W－W 动物痛阈提高百分率亦具有差异（P＜0.05）。见表1。

表1 对热刺激小鼠疼痛的影响（±s，n＝10）

注：与模型组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.01。

120 min痛阈提高百分率（%）正常对照组 - 18.87± 7.44 17.47±6.81 18.42± 5.79 JQF 100 19.78±14.80 35.18±6.71** 54.85±19.54**JQF-A-N-30 8 18.56±17.54 28.23±8.43** 35.67±14.29**JQF-A-E 20 14.55±18.29 25.94±5.43** 30.45±26.62**JQF-A-W-W 40 15.56±16.00 23.37±5.09* 24.66±13.71*JQF-W 24 17.56±16.00 18.37±8.09 20.26±13.71*阿司匹林组 20 28.91±17.33** 45.84±9.60** 47.52±19.54**组别剂量（mg/20g）30 min痛阈提高百分率（%）60 min痛阈提高百分率（%）

2.2 对小鼠痛经模型扭体实验的影响结果提示，所有的分组与正常组比较均有统计学差异说明小鼠痛经模型造模成功，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、和阿司匹林组对缩宫素所致小鼠扭体反应具有显著的抑制作用，与模型对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），JQF-A-W-W 与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），JQF-W对小鼠痛经模型扭体没有抑制作用。

2.3 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响结果提示，与正常组比较，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、和阿司匹林组对二甲苯致小鼠耳廓肿胀有显著的抑制作用（P＜0.01），JQF-A-W-W、JQF-W 与正常组比较没有抑制作用。见表3。

表2 对痛经模型小鼠扭体次数的影响（±s，n＝10）

注：与模型组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.01；与正常组比较，##P<0.01。

组别剂量（mg/只）扭体次数（次）模型组 - 33.9±8.78##阿司匹林 20 5.2±2.81##**JQF 100 8.4±5.52##**JQF-A-N-30 8 12.8±5.72##**JQF-A-E 20 13.9±8.74##**JQF-A-W-W 40 26.9±3.24##*JQF-W 24 29.7±3.24##正常组 - 0.0±0.00**

表3 对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响（±s，n＝10）

注：与模型组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.01。

组别剂量（mg/只）肿胀度（mg）正常组对照组 - 16.78±1.81 JQF 100 8.01±1.42**JQF-A-N-30 8 9.13±1.37**JQF-A-E 20 9.82±1.62**JQF-A-W-W 40 16.29±1.78 JQF-W 24 16.36±1.38阿司匹林组 20 8.13±1.35**

2.4 对大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响

2.4.1 对子宫收缩促进剂（缩宫素、前列腺素F2α、乙酰胆碱）诱发子宫痉挛性收缩的影响结果提示，在给药前，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、JQF-A-WW、JQF-W、吐温-80、阿司匹林组与台氏液对照中的离体子宫标本无差异。加入子宫激动剂缩宫素、PGF2α、Ach 后，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、阿司匹林对子宫痉挛性收缩与加药前有明显的抑制性作用，JQF-A-W-W、JQF-W作用不明显，累计加药有抑制子宫平滑肌收缩的趋势但是没有统计学意义，吐温-80作为助溶剂对大鼠离体子宫平滑肌收缩并没有抑制作用。见表4-5。

2.4.2 对KCL强直刺激的大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响结果提示，在给药前，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、JQF-A-W-W、JQF-W、吐温-80、阿司匹林组与台氏液对照中的离体子宫标本无差异。加入KCL致子宫平滑肌强直收缩，JQF、JQF-A-N-30、JQF-A-E、阿司匹林与加药前子宫平滑肌持续收缩有明显的抑制性作用，JQF-A-W-W、JQF-W作用不明显，累计加药有抑制子宫平滑肌收缩的趋势但是没有统计学意义，吐温-80作为助溶剂对大鼠离体子宫平滑肌收缩并没有抑制作用。

表4 对子宫激动剂刺激大鼠离体子宫平滑肌收缩的影响（±s）

注：分别与任氏液对照组比，**P<0.01。

子宫收缩曲线下面积（mV·s）浓度（g/L）给药前缩宫素 PGF2α Ach台式液对照组 - 0.294 2±0.053 6 1.826 9±0.276 0 1.979 4±0.371 7 1.295 2±0.052 6 JQF 10 0.306 8±0.019 5 0.534 8±0.017 2** 0.988 2±0.100 4** 0.313 2±0.035 1**JQF-A-N-30 0.16 0.314 7±0.024 7 0.985 7±0.034 0** 0.683 2±0.056 3** 0.852 2±0.035 7**JQF-A-E 0.20 0.269 3±0.008 4 0.852 9±0.035 4** 0.321 5±0.006 9** 0.895 4±0.020 5**JQF-A-W-W 0.20 0.324 4±0.021 9 1.625 8±0.002 1 1.588 1±0.021 1 1.204 4±0.005 1 0.40 1.589 4±0.004 6 1.509 1±0.115 7 1.201 5±0.027 6 0.80 1.524 1±0.005 8 1.439 0±0.007 1 1.183 7±0.079 2 JQF-W 0.24 0.279 8±0.010 5 1.768 5±0.047 1 1.672 1±0.125 1 1.227 3±0.103 5 0.48 1.459 4±0.016 2 1.562 1±0.100 9 1.198 7±0.025 1 0.96 1.432 6±0.017 9 1.354 2±0.047 3 0.987 7±0.048 6组别给药后阿司匹林组 0.016 0.336 4±0.040 4 0.323 7±0.039 2** 0.581 9±0.102 8** 0.675 6±0.054 5**吐温-80（mL） 20 0.332 9±0.010 8** 1.791 9±0.010 9 1.884 1±0.067 3 1.225 7±0.025 5

表5 对KCL刺激大鼠离体子宫持续收缩模型的影响

3 讨论

近年来发现，JQF对经重酒石酸去甲肾上腺素，甲磺酸倍他司汀，米非司酮处理的离体子宫均具有缓解痉挛的作用[6]。这种解痉作用一方面与临床研究的结果一致，另一方面对其作用机制也有一定的提示作用。目前对JQF中的某些单味药或复方在解痉过程中的作用有文献研究，如当归精油（含藁本内酯>97%）无论对正常未孕离体子宫还是对缩宫素、PGF2α等处理的离体子宫，都具有缓解痉挛的作用[7]；当归水提液对缩宫素引起的离体小鼠子宫的收缩频率和收缩幅度均有显著抑制作用，芍药水提液则对收缩频率的抑制作用较明显，其中芍药与当归的配伍对收缩频率的抑制作用更强[8]；复方芎归散（当归、川芎两味药组成）总提取物可使大鼠在体子宫平滑肌的收缩力和活动度减少[9]。JQF是临床经验方。其组成：当归、川芎、赤芍、益母草、桂枝等。JQF重用当归补血，补其不足；臣以川芎、益母草行血，行其有余；佐以赤芍凉血，防其动血；使以桂枝温通，缓其拘急。全方攻补兼施，温通补泄并用，力效专攻，共同起到调气和血止痛的效果。

现代医学研究证明，前列腺素几乎存在于全身各种重要组织和体液之中，在女性生殖系统如子宫内膜、月经血及卵巢中均有分布，痛经患者子宫内膜及经血中前列腺素较正常妇女显著偏高[10]，体内过高PGF2α是原发性痛经的主要发病原因，同时前列腺素是人体内与炎症反应有关的物质；缩宫素不仅直接作用于子宫平滑肌引起子宫收缩，而且同时刺激子宫内膜释放前列腺素，两者协同作用引起子宫收缩，原发性痛经患者体内过高的缩宫素可能是导致痛经的原因之一[11]；ACh作用于子宫平滑肌细胞可以引起子宫平滑肌剧烈收缩。本研究结果表明，JQF-A-N-30、JQF-A-E 可以显著抑制 PGF2α、缩宫素和ACh引起的子宫平滑肌条剧烈收缩，尤其对收缩频率加快的抑制作用较强，同时具有抗炎作用。缩宫素、PGF2α、ACh均可作用于平滑肌细胞上各自的受体引起细胞内钙离子浓度（Ca2+）升高，而细胞Ca2+增加可能是引起子宫平滑肌收缩的直接原因。细胞Ca2+增加有细胞外Ca2+内流和细胞内质网钙库释放两种途径。KCl可引起细胞膜去极化导致电压依赖性钙通道开放,细胞外Ca2+内流，最终引起细胞Ca2+升高，因此可建立KCl致子宫平滑肌强直收缩的模型来考察药物对细胞外钙内流所致平滑肌收缩的影响。JQF还可通过其抗炎作用，抑制原发性痛经的形成[12]。

综合整体小鼠抗炎镇痛实验和离体子宫平滑肌实验的筛选结果，JQF-A-N-30和JQF-A-E具有抗炎镇痛作用的同时对离体子宫平滑肌的收缩亦具有直接抑制作用，提示它们可能是JQF治疗痛经的两个活性部位。为此本研究在后续的实验中对它们治疗痛经的作用及其可能的机制进行进一步研究。

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