DPPH法筛选大血藤抗氧化活性有效部位*

冯改利 宋小妹 邓 羽中 豆 勇 陕西中医学院(咸阳 712046)

大血藤(Cau lis Sargentodoxae)为大血藤科植物大血藤(Sargentodoxacuneata(Oliv.)Rehd.Et W ils.)干燥茎,主产于河南、安徽、江苏、浙江、湖北、四川、甘肃等省。其藤茎具有清热解毒、活血通经及祛风除湿等功效,用以治疗肠痈腹痛、经闭痛经、风湿痹痛、跌打扑痛[1]。据文献报道,大血藤化学成分主要以酚酸类为主,酚酸类一般具有抗氧化的活性[2-3]。本实验拟采用 DPPH抗氧化体外实验的方法,筛选大血藤抗氧化的活性部位。为大血藤药理研究和临床应用提供参考。

1 实验材料 1.1 试药 UV 1102紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);电子天平(萨多利斯 GB2042电子天平(瑞典);药材产自四川省地,经陕西中医学院学生药系王继涛高级实验师鉴定为木通科大血藤植物 Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.Et W ils.的干燥茎;抗坏血酸(天津市天力化学试剂有限公司,批号:2010608);2,2-二苯基-1-苦味基肼自由基(DPPH)(批号:CR0032);水为纯净水,其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果 2.1 样品的制备 2.1.1 供试品的制备:取大血藤药材饮片200 g,分别以 10倍量和8倍量的水煎煮2次,合并提取液,于 90℃水浴浓缩至500m L。分别以三氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇200、200、200m L萃取 3次,萃取液于 90℃浓缩至干,以无水乙醇溶解,定容于50m L量瓶中。萃取剩余药液定容至500m L,取100m L,加乙醇至醇浓度到50%,静置,过滤,于 90℃浓缩至干,以50%乙醇定容于 25m L量瓶,配制成相当于生药浓度 4 g◦ m L-1,于-4℃储存备用。

精密称取抗坏血酸 250.11 mg,用无水乙醇溶解定容于 50m L量瓶中,定容得 5.0022 mg◦ m L-1贮备液,置于冰箱中冷藏备用。

2.1.2 对照品的制备:精密称取 DPPH约 3.5m g,用无水乙醇溶解,定容于 50 m L量瓶中,置于冰箱中冷藏备用(临用时配,只能稳定存在 5 h,深蓝色 )。

2.2 抗氧化实验测定方法 测定原理:DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的质子自由基,其乙醇溶液呈紫色,并在 517 nm处有强烈吸收,在有自由基清除剂存在时,自由基清除剂提供一个电子与 DPPH的孤对电子配对,而使其褪色,褪色程度与其接受的电子呈定量关系,在 517 nm处的吸光度变小,其变化程度与自由基清除程度呈线形关系,即自由基清除剂的清除自由基能力越强,吸光度越小[4]。

测定方法:用移液管取2m L已知浓度乙醇,再取2 m LDPPH溶液充分振摇。30min后,于517 nm处测吸光度 A值(Ac);用移液管取样品溶液2m L。再取2m L已知浓度乙醇,充分振摇。30min后,于517 nm处测吸光度 A值(Aj);用移液管取样品液 2m L,再取 2m L DPPH溶液,充分振摇振荡。室温下静置 30m in,测吸光度 A值(Ai)。平行测定2次计算清除率:K=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。 K为自由基清除剂对 DPPH自由基的清除率;Ai为加试样反应后 DPPH溶液吸光度;Aj为不加DPPH,只加试样的溶液的吸光度;Ac为不加试样,只加 DPPH溶液的吸光度[5]。

2.3 DPPH自由基稳定性试验 将配制一定浓度的DPPH乙醇溶液在室温下放置 60 min以上,每隔10min测其吸光度。在室温下放置60m in,其吸光度变异系数为0.2%。结果表明DPPH自由基是一种稳定的自由基,可用以提取物抗氧化活性的分析。

2.4 DPPH吸光值与浓度关系 分别精密移取0.6、0.9、 1.2、1.5、1.8、2.1m LDPPH对照品溶液至10 m L量瓶,用无水乙醇稀释定容,分别得 0.072、0.108、0.144、0.18、0.216、0.252 mg◦ m L-1标准溶液。再分别吸取 2 m L系列标准溶液,按照“2.2”项下测定方法进行测定。以 DPPH质量浓度为横坐标,吸光度(UV)为纵坐标绘制标准曲线,得吸光度与DPPH质量浓度的线性回归方程为Y=3.0587X+0.0078,R2=0.9997。 DPPH在 0.072～ 0.252 mg◦ m L-1之间线性相关。

2.5 阳性对照品清除 DPPH自由基试验 精密量取抗坏血酸标准品溶液1.0m L,依次稀释为原标准液的 1/100,1/200,1/400,1/600,1/800,1/1000,再分别吸取 2m L系列标准溶液,按照“2.2”项下测定方法进行测定。抗坏血酸自由基清除作用与浓度相关,随浓度升高而升高,结果见表1。

2.6 大血藤各萃取部位清除 DPPH自由基研究

将各萃取部位的乙醇溶液按照一定的浓度梯度依次稀释,分别与 2.0m LDPPH溶液混合,振摇 30 s,静置30 min测定吸光度,计算清除率。以抗坏血酸为参照物对各部位的抗氧化活性进行比较。由表2可知,于抗坏血酸的质量浓度相当时,只有大血藤的正丁醇与水部位都具有显著的抗氧化活性,乙酸乙酯和三氯甲烷部位不具有显著的抗氧化活性。

表1 阳性对照品对DPPH自由基清除率

表2 大血藤各部位对 DPPH自由基清除率

图1 抗坏血酸及各提取物与 DPPH反应时间对DPPH清除率的关系

2.7 抗坏血酸及各提取物与 DPPH反应时间对DPPH清除率的影响 各部位萃取物同一浓度(4 mg◦ m L-1)2.0 m L与DPPH混合后分别在0,2.5,5,7.5,10,20,30,40,50,60min测定其吸光度,计算清除率,考察反应终点及反应稳定性。结果见图1。3 讨 论 本实验以体外DPPH法为评价方法,以抗坏血酸作为参照物,研究大血藤不同萃取部位抗氧化活性,研究表明:正丁醇萃取部位和水部位在DPPH自由基清除体系中活性最强,乙酸乙酯部位稍低,三氯甲烷部位抗氧化活性最低。据文献报道,大血藤在同 45味具有抗氧化活性中药比较,显示具有最强的抗氧化活性[2]。为本实验的研究提供了依据。

本研究抗氧化活性比较是建立在抗坏血酸单位质量和大血藤单位生药量的基础上,相对于抗坏血酸而言,大血藤相当的生药浓度的抗氧化活性略弱,从而侧面体现若大血藤有效部位经提取和纯化,能够开发成为一种具有市场潜力的抗氧化剂。

[1] 陆连英.《本草纲目》中红藤本草考证 [J].时珍国医国药,2000,11(2):170-170.

[2] 李华彬,将 跃,王赤春,等.中药提取物的体外抗氧化性能和总酚含量[J].中华文化论坛,2008,8,256-259.

[3] 李钧敏,金则新,陈 彤,等.红藤饮片提取物抑菌活性与次生代谢产物含量的相关性[J].浙江大学学报(医学版),2006,35(3):273-280.

[4] 王 晶,李 丽,刘春明,等.不同红药提取物中总酚的测定及抗氧化活性的 DPPH法评价研究 [J].辽宁中医杂志,2011,38(3):513-515.

[5] 赵 爽,严铭铭,赵大庆,等.小飞蓬总黄酮提取工艺优选及体外抗氧化活性研究 [J].中成药,2011,33(2):348-350.