脂联素基因单核苷酸多态性与急性心肌梗死的相关性研究

梁允兰 史海波

脂联素是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质，研究证实脂联素与胰岛素抵抗密切相关，具有抗动脉粥样硬化(AS)形成、抗炎症和损伤后抗内膜增生的特性。脂联素基因全长17 kb，定位于3q27，全基因组扫描显示该区域存在2型糖尿病、代谢综合征和冠心病的易感位点［1－2］，因此成为糖尿病和冠心病的研究热点。国内外研究表明脂联素在冠心病的发生发展中有重要作用，刘岩等［3］发现血浆脂联素水平与冠状动脉粥样硬化的狭窄程度呈逆相关，并随AS的发展呈进行性下降，低脂联素血症是冠状动脉粥样硬化严重程度的重要标志，是AS发生、发展的独立危险因素;Nakamura等［4］研究发现急性冠脉综合征(ACS)患者脂联素水平要比稳定型心绞痛患者更低，脂联素可用于冠心病的危险评估。因脂联素基因区域有较大频率的基因多态性，因此对定位于染色体3q27区域的人基因单核苷酸多态性(SNPs)与疾病的关系已经成为近年来的关注热点。国外近来已有脂联素基因SNPs与冠心病相关性的研究［5］，但脂联素基因SNPs与急性心肌梗死(AMI)的相关性研究在中国人群中的研究少见。脂联素基因内存在14个SNPs，本研究在中国人群中检测脂联素基因外显子SNP+45和内含子SNP+276基因多态性并探讨这2个SNPs与AMI的相关关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 AMI组78例，为2005年8月至2006年2月住院病人，根据临床表现及冠状动脉造影证实为AMI患者，其中男59例，女19例，年龄39～84岁，平均(46.0±10.8)岁;对照组84例来自健康体检结果正常者，其中男66例，女17例，年龄36～69岁，平均(42.6±10.6)岁，排除心脏病、高血压、高血糖、高血脂等病史。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器与试剂:TGL－16B型高速台式离心机，DK－8D型电热恒温水槽，PTC－100型PCR仪(美国MJ公司)和移液器(德国Eppendorf公司)，DFD型电泳仪(北京东方特力科贸公司)，Multiscan100ES型凝胶成像系统(美国基因公司)。琼脂糖、溴化乙锭(EB)、引物(上海英骏生物)、TaqDNA聚合酶和 DNAmarker(Takara公司)、dNTPs和限制性内切酶RcaI及BsmaI(晶美公司)。

1.2.2 样本采集与DNA提取:抽取AMI组及对照组受试者晨起空腹静脉血3 ml，肝素钠抗凝，美国Promaga公司全血提取基因组DNA试剂盒提取新鲜血基因组DNA，－20℃长期保存。

1.2.3 SNPs分析:PCR扩增上游引物:5'－CTTGGTGAGGAAAGGAGAC－3';下游引物:5'－GAGGAA2TCAGAATATGAATG－3'。PCR 反应体系20 μl中包括含提取 DNA 模板 1.5 μl、10 × Buffer 2.0 μl、25 mmol/L MgCl21.2 μl、Taq 酶 0.2 μl、25 mmol/L dNTP 0.4 μl、10 μmol/L 引物各0.4 μl，双蒸水补足至20 μl，置 PCR仪中。反应条件:95℃预变性5 min;94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min计2个循环然后进入主循环:94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min共40个循环，末次延伸72℃ 7 min。PCR产物为745 bp，上述PCR扩增产物分别以RcaI 37℃，BsmI 65℃酶切过夜，然后用1.5%琼脂糖电泳，以50～2000 bp的DNA marker为参照物，EB染色后紫外线检测SNP+45及SNP+276基因型。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件进行分析。计量资料以±s表示，2组间比较行t检验。计数资料以百分比表示，基因型或等位基因不同分组之间的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

2.1.1 SNP+45位点经RCaI酶切后产生3种基因型，分别为:野生型(TT)、杂合子型(TG)、纯合子突变型(GG)，包含G等位基因的745 bp片段不被RCaI酶切，不含G等位基因的片段被酶切为453 bp和292 bp的2个片段。野生型(TT)显示2根条带(453 bp和292 bp)，杂合子型(TG)显示3根条带(745 bp、453 bp和292 bp)，纯合子突变型(GG)显示1根条带(745 bp)。见图1。

图1 脂联素基因SNP+45电泳结果

2.1.2 SNP+276位点经BSmI酶切后产生3种基因型，分别为:野生型(TT)、杂合子型(GT)、纯合子突变型(GG)，包含G等位基因的745 bp片段不被BSmI酶切，不含G等位基因的片段被酶切为523 bp和222 bp的2个片段。野生型(TT)显示2根条带(523 bp和222 bp)，杂合子型(GT)显示3根条带(745 bp，523 bp和222 bp)，纯合子突变型(GG)显示1根条带(745 bp)。见图2。

2.2 AMI组和对照组基因型频率及等位基因频率比较

图2 脂联素基因SNP+276电泳结果

2.2.1 AMI组和对照组脂联素基因SNP+276基因型分布有显著性差异(P＜0.05)，AMI组GG+GT基因型分布频率高于对照组，而TT基因型在对照组分布频率高于AMI组;等位基因频率未见显著性差异。见表1。脂联素基因SNP+45基因型分布和等位基因频率2组间未见显著性差异。见表2。

2.2.2 AMI组中脂联素基因SNP+276中GG+GT基因型血糖浓度显著高于TT基因型(P＜0.05);AMI组脂联素基因SNP+45为GG基因型者胆固醇浓度高于TG和TT基因型，有显著性差异(P＜0.05)。见表3。

表1 AMI组与对照组脂联素SNP+276基因频率比较(n，%)

表2 AMI组与对照组脂联素SNP+45基因频率比较(n，%)

表3 脂联素SNP+45、SNP+276不同基因型与AMI组血糖和胆固醇浓度的关系(±s，mmol/L)

表3 脂联素SNP+45、SNP+276不同基因型与AMI组血糖和胆固醇浓度的关系(±s，mmol/L)

注:由于SNP+276为GG型者频率较低，因此与GT基因型合为一组进行统计。与SNP+45 GG基因型比较，*P＜0.05;与SNP+276 TT基因型比较，△P＜0.05

指标SNP+45 SNP+276 GG基因型 TT基因型 TG基因型 GG+GT基因型 TT基因型(n＝10) (n＝30) (n＝38) (n＝48) (n＝30)血糖 6.76±2.16 7.98±5.17 7.91±4.52 8.68±5.34△6.16±1.31胆固醇 5.26±1.27 4.28±0.97* 4.41±0.97*4.42±1.23 4.56±0.98

3 讨论

脂联素是脂肪组织特异性分泌的激素样蛋白质，许多研究已经证实脂联素具有抑制巨噬细胞对胆固醇酯的摄取，减少巨噬细胞表面清道夫受体基因的表达，抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化，抑制血管内皮细胞及平滑肌细胞(SMC)的增殖、分化及向皮下损伤区的迁移，抑制SMC向内膜的迁移和增殖，同时还能促进损伤的内皮细胞修复。而内皮细胞、巨噬细胞和SMC正是构成AS灶的三要素。因此脂联素与冠心病之间必然存在重要的密切联系。黄继良等［7］研究显示老年冠心病患者较对照组血清脂联素水平明显降低，且随颈动脉狭窄程度加重，脂联素水平进行性下降，中度和重度组患者血清脂联素水平明显低于轻度患者，但中度和重度组患者血清水平差异无显著性，表明脂联素在由轻度颈动脉狭窄向中、重度颈动脉狭窄发展的过程中起了较重要作用，而重度颈动脉狭窄的发生可能是在脂联素水平下降的基础上，多种因素综合作用的结果。

1996年，Maeda等［8］克隆了人脂联素基因，目前已知人脂联素基因是单拷贝基因，全长17 kb，位于3q27，包含3个外显子和2个内含子。脂联素基因内存在14个SNPs，本研究在中国人群中检测SNP+45(T/G)和 SNP+276(G/T)，并探讨这两个 SNPs与AMI的关系。

本研究结果显示AMI组和对照组脂联素基因SNP+276三种基因型分布有显著性差异(P＜0.05)，AMI组GG+GT基因型分布频率高于对照组。与Filippi等［6］研究结果相似:脂联素基因SNP+276 G＞T与冠心病有显著的相关性，多变量分析显示携带有此基因的人患冠心病的概率增加，并与年龄明显相关(OR＝1.03，P＜0.0001);在早发的冠心病的患者中携带有SNP+276 G＞T者，脂联素水平明显降低。该研究认为脂联素基因的变异或突变决定着低脂联素基因表达，导致动脉粥样硬化(AS)及心血管疾病的发生。脂联素内含子2 SNP+276 G/T则远离剪切位点，其调节RNA水平的确切机制不甚清楚，可能是与不同等位基因造成的不同寡核苷酸转录文本与转录因子的亲和力不同有关。

本研究结果还发现AMI组脂联素基因SNP+276中GG+GT基因型血糖浓度高于TT基因型，与国内学者的研究结果相似［9］:脂联素基因SNP+276 GG+GT基因型与HOMA－IR显著正相关(P＜0.005)。因此我们认为:SNP+276不仅与AMI直接相关，而且与AMI的危险因素相关。

本研究结果虽显示脂联素基因SNP+45基因型分布和等位基因频率2组间未见显著性差异，但AMI组中脂联素SNP+45各基因型胆固醇浓度有显著性差异(P＜0.05)，GG基因型胆固醇浓度高于GT和TT型。与一项法国肥胖人群研究结果相同，SNP+45 T/G与血清胆固醇相关［10］外显子2 SNP+45 T/G属于同义突变G15G，由于位置靠近外显子和内含子的连接部位，故这一编码区的静止突变可能是通过影响mRNA的剪切机制来影响APM21基因的表达，从而调节RNA水平。

脂联素参与AS形成的各个环节，通过多种作用机制抑制血管的炎症反应阻断AS的形成，发挥其抗AS作用。虽然目前为止脂联素抗AS的确切作用机制尚不明确，但是体内体外实验已证实，补充脂联素可有效防止或抑制AS的形成，因此有望成为防治AS的有效治疗手段。

［1］Kissebah AH，Sonnenberg GE，Myklebust J，et al.Quantitative trait loci on chromosomes 3 and 17 influence phenotypes of the metabolic syndrome［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(26):14478－14483.

［2］Francke S，Manraj M，Lacquemant C，et al.A genome－wide scan for coronary heart disease suggests in Indo－Mauritians a susceptibility locus on chromosome 16p13 and replicates linkage with the metabolic syndrome on 3q27 ［J］.Hum Mol Genet，2001，10(24):2751－2765.

［3］刘岩，邹大进，李慧，等.低脂联素血症是冠状动脉粥样硬化严重程度的重要标志［J］.中华内分泌代谢杂志，2005，21(1):5－8.

［4］Nakamura Y，Shimada K，Fukuda D，et al.Implications of plasma concentrations of adiponectin in patients with coronary artery disease［J］.Heart，2004，90(5):528－533.

［5］Filippi E，Sentinelli F，Romeo S，et al.The adiponectin gene SNP+276 G ＞ T associates with early－onset coronary artery disease and withlower levels of adiponectin in younger coronary artery disease patients(age＜or＝50 years)［J］.J Mol Med，2005，83(9):711－719.

［6］黄继良，刘晓君，高燕，等.冠心病者颈动脉内膜中层厚度与血清脂联素水平相关性［J］.实用老年医学，2006，20(1):27－29.

［7］Maeda K，Okubo AK，Shimomura I，et al.cDNA cloning and expression of a novel adipose specific collagen－like factor，APM1(Adipose Most Abundant Gene Transcrip 1)［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，221(2):286－289.

［8］汝颖，马猛，马腾，等.脂联素基因SNP276多态性与冠心病及胰岛素敏感性的相关性［J］.中国循环杂志，2005，20(5):332－335.

［9］Fumeron F，Aubert R，Siddiq A，et al.Adiponectin genepolymorphisms and adiponectin levels are independently associated with the development of hyperglycemia durina 3－year period:the epidemiologic data on the insulin resistance syndrome prospective study［J］.Diabetes，2004，53(4):1150－1157.