80岁以上老年恶性肿瘤患者外周血调节性T细胞检测及其临床意义

尹震宇 郭美姿 黄明敏 陈晓琳 陈军浩 吴虹

我国肿瘤发病率和死亡率均在55～60岁段开始呈大跨度上升，65岁年龄组比55岁年龄组翻1倍，70岁年龄组比55岁年龄组翻2倍，80岁年龄组是55岁年龄组的3倍［1］。这说明，恶性肿瘤已成为老年人的常见病，也是老年人主要的死亡原因。随着内环境的变化，老年人逐渐出现实质脏器的萎缩并伴有功能降低，包括免疫衰退，表现为T细胞活化受损，细胞免疫功能缺陷。因此对外源性抗原的免疫应答降低，而对自身成分产生抗体阳性率增加。CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一组具有免疫抑制功能的T细胞亚群，具有免疫负调节作用，近年来在恶性肿瘤的发生、发展及预后中的作用更是备受关注，成为免疫学和肿瘤学领域研究的热点［2］。本研究旨在探讨Treg在≥80岁老年恶性肿瘤患者中的作用。

1 资料和方法

1.1 临床资料 ≥80岁老年恶性肿瘤组(肿瘤组)患者均为我院老年科2010年6月至2011年3月住院患者，均经病理证实。共70例，男65例，女5例，年龄80～91岁，平均(84.0±3.59)岁。其中肺癌17例，肠癌14例，胃癌12例，前列腺癌9例，肝癌7例，食管癌2例，胰腺癌2例，胆管癌2例，膀胱癌2例，肾癌2例，乳腺癌1例。根据国际抗癌协会标准进行临床分期，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期9例，Ⅲ期14例，Ⅳ期36例。根据Karnofsky法评定患者功能状态，其中0分1例，10分2例，20分6例，30分4例，40分11例，50分12例，60分4例，70分4例，80分5例，90分17例，100分4例。老年健康对照组(对照组)均为健康体检者，30例，男27例，女3例，年龄80～98岁，平均(83.7±4.63)岁，符合中华医学会老年医学分会提出的健康老年人标准。2组的年龄及性别比差异无统计学意义。

1.2 方法 恶性肿瘤患者于入院次日晨6:00自肘正中静脉取血2 ml，EDTA抗凝。应用荧光直接标记法及流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+Treg细胞水平。取不同荧光标记的单克隆抗体(PE标记的CD4抗体，FITC标记的CD25抗体，Cychrome标记的CD69和 CD45 RA 抗体)各20 μl，分别加入100 μl肝素抗凝的外周血，室温下孵育15 min，加红细胞裂解液，PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测，Cellquest软件分析数据，记录阳性细胞百分率，减去非特异对照值。另取2 ml采用日立7600全自动生化仪用免疫比浊法检测血清C－反应蛋白(CRP)。

1.3 统计学方法 应用SPSS 15.0统计软件进行分析。所有计量资料用均数±标准差表示，2组间比较采用t检验。2组间计数资料比较采用卡方检验。2个变量间的关系采用Pearson或Spearman直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组和对照组血浆Treg水平及血清CRP水平比较 肿瘤组血浆Treg、血清CRP水平与对照组比较明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 肿瘤组和对照组血浆Treg、血清CRP水平比较(±s)

表1 肿瘤组和对照组血浆Treg、血清CRP水平比较(±s)

注:与对照组比较，＊＊P＜0.01

组别 Treg(%) CRP(mg/L)肿瘤组(n＝70) 9.08±4.12＊＊ 18.92±29.02＊＊对照组(n＝30)6.09±1.41 0.87±0.65

2.2 直线相关分析 肿瘤组血浆Treg水平与血清CRP水平及肿瘤 TNM分期呈正相关(r＝0.416、0.248，P均 ＜0.01)，与 KPS评分呈负相关(r＝－0.438，P ＜0.01)。

3 讨论

当机体发生肿瘤时，肿瘤细胞可以凭借多种方式逃避免疫系统的监控而分裂生长。Treg是一组具有免疫抑制功能的T细胞亚群，于1995年由Sakaguchi等在对小鼠自身免疫性疾病的研究中首次发现。Treg来源于CD4+的T细胞，为胸腺发育过程中经历阴性和阳性选择时部分自身反应性T细胞逃避选择的结果。它占正常人外周血CD4+T细胞的5%～10%，具有免疫负调节作用，在维持自身免疫耐受等病理生理过程中有着不可替代的作用，近年来在恶性肿瘤的发生、发展及预后中的作用更是备受关注，成为免疫学和肿瘤学领域研究的热点［3］。无论在肿瘤环境下还是在疫苗诱导下的抗肿瘤免疫中，Treg都扮演了负面角色。许多肿瘤抗原为自身抗原，Treg能抑制T细胞对外来和自体抗原的免疫应答，因而在维持对自身成分耐受的同时也会阻止机体对肿瘤细胞的免疫应答，从而导致了肿瘤的免疫逃逸［4］。Salama等［5］通过免疫组化方法观察967例临床分期为Ⅱ期、Ⅲ期的结直肠癌患者组织中Treg的分布情况，结果显示Treg在肿瘤组织的比率远高于正常肠黏膜，而且Treg与临床分期、生存率明显相关，进一步行多元回归分析提示Treg是结直肠癌预后的独立危险因子，Treg越高，预后越差。Tzankov等［6］应用ROC工作曲线，分析了Treg在1019例不同类型的淋巴瘤中的诊断价值。结果表明，肿瘤组织中Treg的数目与经典霍奇金淋巴瘤肿瘤的总生存率、无病生存率明显相关，与惰性淋巴瘤的无病生存率、疾病生存率相关，与弥漫大B细胞淋巴瘤的疾病生存率相关。通过对肿瘤患者外周血及肿瘤微环境中Treg的研究发现，头颈部鳞癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤患者体内的Treg的数目亦明显上升，其数量与病人的生存率明显相关［7－13］。环境中Treg比率增加，抑制了体内效应性 T细胞的抗肿瘤免疫反应，导致肿瘤免疫失调，从而促进了肿瘤的快速生长及侵袭和转移。

目前，Treg数目是否随着年龄的增加而增多仍存在争议［2，14－15］，Treg 在≥80 岁老年人恶性肿瘤中的作用如何?国内外鲜见报道。为剔除年龄因素的影响，本研究比较了≥80岁的老年人恶性肿瘤患者及≥80岁健康老年人外周血中Treg的比率。结果显示，≥80岁老年恶性肿瘤患者外周血Treg比率明显高于同龄健康老年人(P＜0.01)。提示恶性肿瘤患者Treg数目增加是肿瘤免疫抑制的机制之一，亦可能是导致机体免疫力下降的原因之一。因此，在≥80岁老年恶性肿瘤患者中检测外周血Treg比率具有一定的临床意义。CRP为急性时相蛋白，在正常人血清中含量很低。在恶性肿瘤时，机体释放多种细胞因子，这些细胞因子一方面促进肿瘤转移，另一方面可调节诱导肝细胞合成大量的CRP，因此血清中CRP的变化对了解恶性肿瘤患者的状态有着重要意义。一般来说，高水平的CRP浓度或进行性升高均提示预后不良，往往预示肿瘤的转移扩散，当病情得到缓解时又迅速恢复正常，因此认为CRP可以作为判断恶性肿瘤预后的参考指标。我们的研究显示，≥80岁老年恶性肿瘤患者血清CRP浓度明显高于同龄健康老年人，差异有统计学意义(P＜0.01)。通过直线相关分析，结果显示，在≥80岁老年恶性肿瘤患者中，外周血Treg比率与CRP浓度呈正相关(r＝0.416，P＜0.01)，提示Treg可能亦可作为判断恶性肿瘤预后的参考指标。目前，肿瘤的临床分期及患者的行为状态成为肿瘤明确的预后因素。为此，我们通过直线相关分析，进一步分析了外周血Treg比率与肿瘤临床分期及KPS评分之间的相关关系。结果表明，在≥80岁老年恶性肿瘤患者中，外周血Treg与肿瘤的临床分期呈正相关，与KPS评分呈负相关关系，进一步支持检测≥80岁老年恶性肿瘤患者外周血Treg比率，可评估肿瘤患者的预后。

由于本研究样本量较小，且肿瘤病种较多，无法进一步行ROC曲线分析Treg在诊断恶性肿瘤的敏感性、特异性。在我们的研究中，Treg比率与临床分期、CRP浓度、KPS评分的相关系数数值偏小，可能与各种肿瘤细胞的代谢及浸润程度有关。故今后还需进一步的研究证实检测Treg在≥80岁老年恶性肿瘤患者中的临床意义。

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