利用大孢子技术培育黄瓜单倍体的前期研究

盛 慧

（哈尔滨市农业科学院，黑龙江哈尔滨 150070）

培育抗逆性强、抗多种病害、适应性广、产量高且商品性好的黄瓜新品种是黄瓜育种工作的核心任务[1]。传统的育种方法费时、费力且效率较低，加之资源匮乏，选育品质好、产量高的新品种就变得更加困难。采用单倍体育种方法进行品种选育弥补了传统育种的许多不足，成为人们关注的焦点。由于单倍体植株的基因型和表现型完全一致,大大降低了误选频率[2]；而且以单倍体为诱变材料,突变隐性基因性状就可表现出来，获得突变体的速度可大大加快，从而缩短了育种年限，并可快速产生纯合的育种新材料（纯系），为提高育种效率提供了可能；还可作为遗传转化的优良受体材料。但是，由于单倍体培育受到诸多因素的影响，造成单倍体育种进展缓慢。到目前为止，国内还没有完整的黄瓜单倍体育种体系，虽然报道较多，但重复性均较差，更没有见到单倍体育种的后续研究。由此可以说明，单倍体育种在国内仍属于未攻克的学术难题[3]。本研究利用黄瓜未授粉子房（胚珠）培养，即所谓的大孢子[4]培养技术诱导黄瓜单倍体。经长时间的努力，确定了预培养的必要性和培养基及不同基因型预培养的条件，并确定了胚状体诱导的高效培养基，诱导率可达92%。文章总结了试验中遇到的问题及相应的解决方法，为后续的器官分化和生根培养打下一个坚实的基础[5]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料：津园5号（华南型）、哈研2186（欧洲温室型）、均由东北农业大学园艺学院黄瓜分子育种实验室提供。

1.1.2 试剂：外源调节剂均购自北京益利公司。

2.2 方法

2.2.1 外植体的处理及灭菌：于早上8点到9点之间将次日要开花的子房采摘下来，采摘后立即进行消毒处理。津园5号在消毒前除去掉雌花外还需将刺溜刮去，原因有以下两点：一是除菌效果不好，即使添加表面活性剂也不易除去刺溜中间的细菌；二是刺溜吸收养分的能力强于胚珠，因此在培养中就会出现由刺溜发育而来的愈伤组织，而胚珠部分因无法吸收到营养而褐化死亡的现象。外植体灭菌过程中氯化汞的使用时间不要超过5min，否则影响预培养的效果。

2.2.2 预培养：预培养对于胚状体的诱导极为重要。不同基因型在预培养培养基上没有明显差异，但在培养条件上差异显著。津园5号预培养只需将子房块接种于预培养培养基上，放于室温下培养即可，光照时间16h/8h，1500~2000lx。哈研2186将子房块接种在预培养培养基上后，需放置在恒温培养箱中，35℃暗培养3天[6，7]，而后放于室温下培养。子房块的大小对于诱导效果也至关重要，应尽量保持一致，一般1~2mm最佳，过大无胚珠膨大现象，过小子房块会干瘪死亡。预培养培养基为：MS+0.1mg/LTDZ+0.1mg/L NAA，4%Sugar，0.8%Agar。

2.2.3 胚状体诱导：子房块在预培养7天后转接到胚状体诱导培养基上。诱导培养基中的外源调节剂的种类和计量是一个需要反复摸索的重要因素，尤其是生长素和细胞分裂素的对比情况[8，9]（详见表1）。经过7~10天的培养，津园5号的胚珠会出现明显膨大现象，并且周围的表皮组织白化死亡。继续培养一段时间后会发现，胚状体突破珠被向上生长并且始终保持鲜绿状态。哈研2186经过10~15天的培养后可见胚珠膨大现象，但不如津园5号明显。继续培养一段时间后胚状体突破珠被向上生长，但数量少于津园5号。其中，津园5号胚状体诱导率可达92%，哈研2186略少（详见表 2）。

表1 诱导培养基中外源调节剂配比情况

表2 不同外源调节剂对诱导效率的影响

3 结果与分析

3.1 预培养

不进行预培养的子房块胚珠没有膨大现象，更没有胚状体的形成，可见预培养对于启动雌核发育起到相当重要的作用。

3.2 胚状体诱导

对于不同基因型而言，胚状体的形成时间是有一定差异的。例如，华南型黄瓜胚状体的形成要早于欧洲温室型。具体原理还有待于进一步研究。

诱导培养基中生长素/细胞分裂素的比值在胚状体诱导过程中起着相当重要的作用。随着比值的减小，胚状体诱导率逐渐增减，当比值为1时，胚状体诱导率达到92%。但是有一点必须注意，虽然诱导率提高了，但随着比值的接近，愈伤组织量也在逐渐增加。经过一段时间培养后，愈伤组织会出现硬化、死亡现象，并且影响胚状体的进一步生长。说明生长素/细胞分裂素的比值对于胚状体的继续生长和器官分化起着关键的作用。因此，不能盲目追求高诱导率。试验中发现6号培养基和1号培养基诱导率虽然只有72%和84%，但是胚状体的生长速度较其他培养基快，可作为最终的诱导培养基。

3.3 分化培养

待绿胚形成后立刻将种皮去掉，并将胚小心转接到分化培养基上。分化培养基为MS+0.20 mg/L 6-BA+30 g/L Suc+0.8%Agar，pH 5.8。培养条件为：温度 22 ℃~25℃，光/暗周期为14 h/10 h。5~7天后便可观察到有植株形成。不同基因型对分化效率具有一定影响，具体情况见表3。

表3 基因型对分化效率和成苗效率的影响

4 存在的问题及展望

4.1 存在的问题

4.1.1 季节：季节对于单倍体培育有一定影响。总体来说，秋季的诱导率要高于春季，且不易污染，但时间较短。冬季的诱导效果一般，但污染率低，接种后最好放于人工气候箱中。

4.1.2 基因型：基因型不同诱导效果有差异，但不是造成单倍体培育困难的关键因素。同一种培养基可以诱导不同的基因型，只是诱导效率高低不同而已，但差距不会很悬殊。

4.1.3 培养基：归根结底，导致单倍体培育失败的原因还是我们没有找到合适的培养基。基本培养基选择中，MS要好于N6和White；培养基中外源调节剂的种类及含量直接影响着试验的成败。胚状体在进行器官分化时要适当减少2，4-D的用量。

4.1.4 培养条件：培养条件各文献报道中没有明显差异，均为室温（25±1）℃，光照 1500~2000 lx。

4.2 展望

单倍体培育对于研究作物遗传育种起着重要的作用[10~12]。它在新品种培育方面、亲本鉴定方面以及分子生物学研究方面意义重大[13，14]。目前，国外在单倍体培育方面已取得了相当大的成绩[15]；而国内还处于研究阶段，虽屡见报道但重复性较差。单倍体育种工作道路艰难，作为育种工作者还须继续努力，探讨出诱导效率高且重复性较好的培养基，创造利于单倍体生长的优越条件，为单倍体育种的后续研究打下一个坚实的基础。

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