发状念珠藻的分离纯化及人工培养条件研究*

苏振宏 王 芳 尹美珍

(黄石理工学院医学院，湖北黄石435003)

0 引言

发状念珠藻(Nostoc flagelliforme Born.et Flash.)是一种具有异型胞经济型固氮蓝藻，俗名头发菜、地毛、发菜等，分类系统中属于原核生物界(Procaryotae)，蓝藻门(Cyanophta)，蓝藻纲(Cyanophceae)，念珠藻属(Nostoc)。在我国主要分布于北部和西北部荒漠、半荒漠地区，能进行光合作用和固氮作用，是荒漠土壤中有机氮和碳的重要来源之一，具有重要的生态学作用。随着市场对发状念珠藻的需求逐渐增加，人们大面积的采集，乱拣乱搂，已造成该资源渐趋枯竭，导致草场退化和沙化，严重破坏了生态环境，影响了农牧民的正常生产和生活，在一些地方还影响到民族团结和社会稳定，如何解决这个难题是藻类学家的当务之急[1，8]。依据 2000 年《中华人民共和国野生植物保护条例》的有关规定，将发菜的保护级别由目前的二级调整为一级。长期以来人们一直试图采用人工培养的方法增加其生物量，以满足日益增长的市场需求，而目前发状念珠藻人工培养又尚未取得理想进展[2，8]。笔者从天然发状念珠藻原植体中分离纯化细胞，并对其液体悬浮培养生长特性进行了相关研究，旨在为解决野生发状念珠藻资源日趋减少而减轻采集野生发菜而产生的环境压力，为野生发状念珠藻大规模人工培养提供科学参考。

1 材料

1.1 试剂和仪器

植物光照生长箱、玻璃匀浆器、细菌过滤器、三角瓶、全自动高压灭菌锅、分光光度计、超净工作台、离心机。BG11培养基组成(1 000 mL)如表1所示(BG110就是 BG11培养基不加NaNO3)。

表1 BG11培养基配方

1.2 材料

发状念珠藻采集于甘肃省陇西县，实验时已在室温干燥保存半年。实验前取少许除去表面尘埃和杂物，再用无菌BG-11清洗至少6次。70%的酒精消毒5～10 min，然后在温度 25 ℃ ，光照 40 μmol·m-2·s-1的条件下用已灭菌BG-11培养液浸润4～6 h至不再吸水膨胀后备用[3]。

2 方法

2.1 发状念珠藻细胞的分离纯化

利用匀浆器研磨清洗准备好的发状念珠藻材料，由于匀浆机械作用，可产生大量藻丝体和游离单细胞，然后稀释成不同浓度接种于BG110固体培养基上，挑选单藻落单培养。经镜检确定为无杂藻杂菌纯发状念珠藻培养物后，一部分保种保存培养于BG11固体培养基上，另一部分培养在50 mL BG11液体培养基中[3]。

2.2 发状念珠藻细胞的培养

2.2.1 藻种培养

将发状念珠藻分别接种到固体BG11(保种)和液体BG11培养基。置于光照培养箱内培养。温度控制在25±1℃，光照强度在40 μmol·m-2·s-1，光 照 /黑 暗 为 10/14 h 连续培养1个月，液体培养物每天振摇至少2次(注:不要溅起到棉塞上)，每次转接都经镜检无杂菌杂藻，然后再扩大培养。

2.2.2 考察发状念珠藻在 BG11和 BG110的生长状况

分别将发状念珠藻藻种研磨接种到BG110和BG11 500 mL液体培养基中，接种密度(A750)为 0.20～0.22。温度控制在25 ±1 ℃，光照强度在40 ±2 μmol·m-2·s-1，连续培养18 d，每组3个重复。每隔1 d定时取样，用722型可见分光光度计，于560 nm波长下测光吸收值。以生长时间为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制生长曲线[4-6]。

2.2.3 温度对发状念珠藻生长影响

将生长良好的发状念珠藻研磨接种到BG110500 mL液体培养基中，接种密度(A750)为0.20～0.22。温度分别控制在 8、16、25、28、35 ℃，光照培养箱内连续培养18 d，每个培养箱光照强度都在40±2 μmol·m-2·s-1，每组 3 个重复。每隔1 d定时取样，用722型可见分光光度计，于560 nm波长下测光吸收值。以生长时间为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制生长曲线，考察光照强度对藻生长的影响[4-6]。

2.2.4 光照对发状念珠藻生长影响

将生长良好的发状念珠藻研磨接种到BG110500 mL液体培养基中，接种密度(A750)为 0.20 ～0.22。温 度 控 制 在25±1℃，光 照 强 度 分 别 设 在 25、50、75 μmol·m-2·s-1连续培养 18 d，每组 3 个重复。每隔1 d定时取样，用722型可见分光光度计，于750 nm波长下测光吸收值。以生长时间为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制生长曲线，考察光照时间对藻生长的影响[4-6]。

3 结果

3.1 发状念珠藻细胞的分离纯化

研磨清洗浸泡好的发菜原植体，逐渐颜色加深，经镜检有大量的藻丝体释放，同时有少量的原植体(见图1)。接种于BG11固体培养基上，有一些平板上虽然生长大量的藻落，但浓度过大，藻落与藻落之间相连，并且有大量霉菌污染，选取适宜的浓度平板，挑选无杂藻杂菌污染的单藻落培养(见图2)。为确保有些藻落混有杂藻或杂菌，研磨后涂平板，再挑取独立的藻落进行单克隆培养，从而成功获得纯发状念珠藻藻种。

图1 经研磨原植体释放的藻丝体

图2 接种于固体培养基上的单藻落

3.2 发状念珠藻细胞的培养

3.2.1 考察发状念珠藻在 BG11和 BG110生长状况

蓝藻培养基有 BG11、BG110、朱氏、HGZ等，发状念珠藻属于典型具异型胞的蓝藻，可通过自身合成大量氮源，所以考察发状念珠藻在BG11和BG110培养基上生长状况，对以后大规模开发应用意义重大。BG11和BG110培养基中发状念珠藻生长状况如图3所示。从图3可以看出发状念珠藻在BG110培养基中起初5 d生长速度明显低于 BG11，延滞期约5 d，而生长到16 d后基本没有太大区别，A750均达到0.46以上。从而说明将来大规模养殖时可考虑用BG110培养基培养。

图3 在BG11和BG110培养基中发状念珠藻生长状况

3.2.2 温度对发状念珠藻生长影响

温度是生物体生命活动的一个重要影响因子。过高的温度会导致生物体活性物质变性;过低的温度则导致生物体酶活力不够，同样影响生物体新陈代谢。分别接种培养在8、16、25、28、35 ℃ 光照培养箱内，连续培养18 d，测定其生长状况，结果见图4。由图4可知，低温不利于形成一定量的生物量，在8℃培养18 d A750增加了不到0.1。较高温度发状念珠藻生长到后期产生生物量反而不如28℃，在28℃下发状念珠藻生长最快，是该藻株最适生长温度[7]。

图4 温度对发状念珠藻生长影响

3.2.3 光照对发状念珠藻生长影响

发状念珠藻属于光合自养型生物，利用环境中无机盐及CO2就可以生长，但光照是不可或缺的。然而如果光照强度过高则会造成悬浮培养藻细胞伤害，反而不利于其生长。分别培养在 25、50、75 μmol·m-2·s-1光照培养箱内，连续培养18 d，测定其生长状况，光照强度对发状念珠藻生长影响如图5所示。由图5可知，在培养初期较低光强其生长速度反而更适宜生长，等培养约 4 d 后 25 μmol·m-2·s-1生长较50 μmol·m-2·s-1慢，而在 75 μmol·m-2·s-1生长一直不佳，可能悬浮培养发状念珠藻光饱和点要低于这个点，光太强反而对其生长造成严重影响。以后大批量培养时选择50 μmol·m-2·s-1。

图5 光照强度对发状念珠藻生长影响

4 讨论

目前，对发状念珠藻的需求逐渐增加，人们大面积的采集，已造成该资源渐趋枯竭，且严重破坏了生态环境，如何解决这个难题是藻类学家的当务之急[1，8]。我们采自野外发菜原植体为实验材料，经平板培养，成功分离纯化而得到单藻落。进而进行了其人工培养条件研究，筛选培养基实验证明在BG11培养基上发状念珠藻生长比BG110上好，但到后期二者差异不大，可能是由于发状念珠藻形成异型胞可自身固定空气中氮的缘故，这点说明将来规模化生产可直接选择BG110，但平时小试验就选择BG11。在温度考证试验中可知28℃是该藻种最佳生长温度，培养18 d其生物量可增加到2.3倍。而光照实验显示选择光强在50 μmol·m-2.s-1时发状念珠藻生长最快。

[1]唐进年，赵明，张盹明，等.发菜的生物学特性及资源保护[J].中国野生植物资源，2000，19(5):20-24

[2]梁文裕，孙兰芳，王俊.发菜人工培养的研究进展[J].农业科学研究，2007，28(1):40-44

[3]胡春香，刘永定，宋立荣，等.半荒漠藻结皮中藻类的种类组成和分布[J].应用生态学报，2000，11(1):61-65

[4]毕永红，胡征宇.温度、营养和光强对发状念珠藻生长的影响[J].过程工程学报，2004，4(3):245-249

[5]纪丽莲，李文谦，赵玉萍.盱眙地皮菜的液体培养研究[J].江苏农业科学，2007(1):159-161

[6]XueFeng Chen，ShiRu Jia，SiJun Yue，et al.Effect of solid bed-materials on vegetative cells of Nostoc flagelliforme[J].Journal of Applied Phycology，2010，22:341-347

[7]潘晓洁，常锋毅，万成炎，等.滇池与洱海鱼腥藻的分离纯化及其生长特性的初步研究[J].水生态学杂志，2010，3(1):60-66

[8]杨新芳，乔木，朱自安.近十年发菜的研究进展[J].中央民族大学学报:自然科学版，2010，19(3):16-21