超声波提取－恒波长同步荧光法测定淡水藻中叶绿素a的含量

吴俊森 万修志 马永山 孙韶华

(1．山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南250101;2．济南市供排水监测中心，山东济南250033)

由于受到水源富营养化的影响，我国许多以湖泊水库为水源的给水厂原水含有不同程度的藻类，藻类会释放藻毒素，威胁供水水质的安全。叶绿素是藻类的主要光合色素，常见的是叶绿素a，其含量大约是藻干重的1% ～2%，是藻类生物量的重要指标［1］。目前国内在该领域采用的叶绿素a测定方法多采用分光光度法和普通荧光法，因分光光度法不如荧光法灵敏，现在多采用荧光法。但对绿藻来说其色素种类较多，特别是存在叶绿素b，其荧光激发和发射光谱与叶绿素a有严重重叠，再加上噪音信号的干扰，利用普通荧光光谱很难单独对叶绿素a进行定性和定量分析［2］。

为避免其它色素光谱的干扰，人们多采用同步荧光法对叶绿素a的荧光光谱进行测定［3］，该方法同时扫描荧光分光光度计的激发和发射两个单色器波长，由测得的荧光强度信号与对应的激发波长(或发射波长)构成光谱图。与常规荧光法相比，同步荧光法能够简化光谱，减少瑞利散射和拉曼散射的干扰，使谱峰变窄，从而提高了测定的选择性和灵敏度。黄贤智等建立了叶绿素a和叶绿素b的同步荧光分析法并用于菜叶中两种色素的测定［4］;唐尧基等应用同步荧光法分析了海水中叶绿素a的含量［5］。同步荧光法用于绿藻中叶绿素a的测定尚未见文献报道。此外，传统叶绿素的提取，耗时长且有可能提取不完全，近来，超声波提取(也称为萃取)以其提取温度低、提取率高、提取时间短的独特优势被广泛应用于中药材和各种动、植物有效含量的提取。我们通过比较不同提取方式发现，选择小球藻为分析对象时，以90%丙酮为提取剂，采用超声波提取法，可节省操作步骤，并有助于提高叶绿素提取效率。在此基础上，本文以小球藻为例，建立了超声波提取－同步荧光法测定绿藻中叶绿素a含量的新方法，其线性范围为 0．02 ～1．25 mg/L，检出限为1．6ug/L。

1 实验部分

1．1 供试生物材料与培养方法

本试验所用小球藻种由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供。采用一次性培养方法，温度为25℃ ±1℃，光强为3000Lux，培养液采用SE培养基，用于实验的藻液为接种2次以上的已适应上述生长条件的处于指数生长期的藻。

1．2 仪器与试剂

KQ250DB型浴槽式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);TBL－40B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂);0．45μm醋酸纤维滤膜(上海半岛实业有限公司净化器材厂)。F－4500型荧光分光光度计(日本日立公司)，扫描速度240 nm/min，带通5nm;叶绿素a、叶绿素b(Sigma公司):分别用90%丙酮配制成1．0 mg/10mL的储备液，保存于冰箱中(4℃)备用。所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1．3 实验方法

取适量叶绿素a、b标准溶液置于10 mL容量瓶中，用90%丙酮稀释至刻度，摇匀;采用荧光分光光度计，选择适当的激发和发射波长，测定标样的荧光激发和发射光谱以及同步荧光光谱。取培养好的小球藻溶液，加入体积为水样5%的饱和碳酸镁溶液，用0．45μm水溶性醋酸纤维滤膜减压过滤，使小球藻截留在滤膜上，抽干，再加入10mL90%丙酮提取剂，盖好，超声波萃取0．5h(超声功率:100%)，离心后取上清液进行同步荧光法测定。

2 结果与讨论

2．1 萃取方式对叶绿素提取效果的影响

研究了各种萃取方式包括加热法、研磨法及超声波萃取法等对叶绿素a提取效果的影响，结果证明当以90%丙酮为提取剂，采用超声波提取方式，可节省操作步骤及时间，并有助于提高叶绿素提取效率，比国家环保总局《水和废水监测分析方法》推荐的研磨法提取效率高。

2．2 荧光光谱谱图

分别扫描90%丙酮空白、小球藻浸泡液和叶绿素a－90%丙酮溶液的荧光光谱。采用λex=444nm扫描荧光发射光谱，λem=660nm扫描其荧光激发光谱，△λ=216nm扫描其同步荧光光谱;扣除90%丙酮后，得叶绿素a标准液的荧光激发光谱、荧光发射光谱以及同步荧光谱图(图1)。

图1 叶绿素a标准液的荧光激发(实线)、发射(折线)及同步荧光(点线)光谱

分析小球藻提取液中的叶绿素a时，所分析的体系未经提取、净化等步骤，待测溶液存在一定的干扰，叶绿素a的激发和发射光谱受其它色素特别是叶绿素b的干扰而变形，峰形不如同步谱那样完整。如图2所示。因此选用同步荧光光谱用于分析小球藻提取液，比激发谱或发射谱更有利于在复杂的体系中区分出叶绿素a的信号。

2．3 叶绿素b干扰考察

考察了叶绿素b对叶绿素a同步荧光信号强度的影响情况。在叶绿素a的90%丙酮标准溶液(0．5mg/L)中加入 0．2mg/L、0．4mg/L、0．6mg/L、0．8mg/L、1．0mg/L 的叶绿素b，检测加入后的荧光信号，并与未加叶绿素b的叶绿素a溶液的荧光信号作比较，结果表明，叶绿素a的同步荧光信号基本不受叶绿素b的影响。小球藻浸取液中还有其他色素物质的存在，如叶黄素和胡萝卜素等，这些物质的荧光激发和发射光谱与叶绿素a的没有干扰，不对该分析体系造成明显的影响。

图2 小球藻浸泡液的荧光激发(实线)、发射(折线)及同步荧光(点线)光谱

在同一小球藻提取液样品中加入不同量的叶绿素a，选用△λ=216nm进行萃取液的同步荧光扫描，由同步荧光峰信号(高度)对应其浓度绘制工作曲线，如图3所示。叶绿素a的加入量与同步荧光峰强度F呈良好的线性关系，因此，同步荧光法对消除小球藻中存在的其他色素和干扰物质对测定的影响是非常有效的。同步荧光法用于测定绿藻中叶绿素a的含量是可行的。

图3 叶绿素a加入量与荧光强度关系标准曲线

2．4 工作曲线及检出限

采用同步荧光法对叶绿素a的90%丙酮标准溶液进行荧光扫描，由同步荧光峰信号(高度)对应其浓度绘制工作曲线，其线性回归方程为Y=3110．5x+198．48，相关系数为0．9991，线性范围为0．02 ～1．25 mg/L。在相同的实验条件下测定11份小球藻空白，根据3倍标准偏差计算其检出限为1．6ug/L。对叶绿素a含量为1．0mg/L的标准溶液进行了11次平行测定，其相对标准偏差为0．48%。

2．5 加标回收实验

为了考察方法的可靠性，课题组对本实验室培养的小球藻提取液样品进行加标回收实验，分别添加浓度为0．5mg/L的叶绿素a标准溶液到样品中，平行三次，测得回收率在97．0% ～104%之间，结果说明，建立的方法对小球藻中叶绿素a的测定准确度能够满足测定要求。实验结果见表1。

表1 样品中叶绿素a回收率的测定结果

2．6 同步荧光法与分光光度法测定结果的比较

对4份小球藻萃取液样品分别采用国家环保总局《水和废水监测分析方法》推荐的分光光度法和同步荧光法进行叶绿素a的重复测定，结果列于表2，由数据对比可以看出同步荧光法与分光光度法测定结果无显著性差异，但该方法具有快速、灵敏，其他常见色素不干扰测定的优点。

表2 分别采用分光光度法及同步荧光法获得的小球藻提取液中叶绿素a浓度

3 结论

绿藻色素成分复杂，采用超声波提取－同步荧光检测法测定绿藻中的叶绿素a，节省了操作步骤，提高了叶绿素提取效率，避免了散射干扰，方法选择性和灵敏度高，检出限达到1．6ug/L，而且具有简便快捷的特点，能够满足供水快速检测的需要。

(编辑:温武军)

［1］吕洪刚，张锡辉，郑振华，欧阳二明．原水藻与叶绿素a定量关系的研究［J］．给水排水，2005，31(2):26－29．

［2］高洪峰，焦念志．通过藻类色素分析估测海洋浮游植物生物量和群落组成的研究进展［J］．海洋科学，1997(3):51－53．

［3］Patra D，Mishra A K．Recent Developments in Multi-component Synchronous Fluorescence Scan Analysis［J］．Journal of Scientific and Industrial Research，2002，21(12):787 －798．

［4］黄贤智，许金钩，蔡挺．同步荧光分析法同时测定叶绿素a和叶绿素 b［J］．高等学校化学学报，1987，8(5):418 －420．

［5］唐尧基，游文玮，陈莹，李耀群．同步荧光法测定海水中叶绿素a的含量［J］．分析仪器．2004，(3):24－26．