大豆茎中黄酮类化合物的提取及抗氧化作用研究

刘立新,郑春辉,徐 成,王 雪

(佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)

大豆(Glycine max),中国古称菽,是一种其种子含有丰富的蛋白质的豆科植物。大豆作为中药和食品被广泛地应用,大豆的栽培遍及世界各地[1,2]。大豆中含有大量的生物活性物质 ,包括磷脂、维生素类、异黄酮、大豆皂苷等。其中大豆异黄酮的抗癌活性尤为突出。大豆异黄酮不仅对乳腺癌、前列腺癌和结、直肠癌显著有效,而且对胃癌、肝癌和白血病及其它一些癌细胞系的生长、增殖具有抑制作用。目前,对于大豆类黄酮的研究主要集中于大豆种子,而对大豆茎黄酮的研究尚未见报道。

大豆茎为大豆的地上茎。有文献报道[3],大豆茎中含有多种化学成分,如大豆皂醇、大豆素、洋芹素、β-胡萝卜苷和黄酮等。我国大豆茎资源丰富,每年产量可达上亿吨,由于其易燃并且热度高,在农村通常被用作燃料,这是一种极大的浪费。本研究以大豆茎为原料进行黄酮类化合物的提取,并对其抗氧化活性进行研究。这一研究将为大豆茎进行综合有效地利用,并对其进一步开发和工业生产提供有意义的参考价值。

1 材料、试剂、仪器

1.1 主要材料

原料:大豆茎购自佳木斯市桦南县农村。

试剂:芦丁标准品,上海生化制剂厂。三氯甲烷、碘化钾、过氧化氢、冰乙酸、硫酸亚铁、氢氧化钠、水杨酸等均分析纯。

1.2 主要仪器

Spectrumlab54紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司);FA2004电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);旋转蒸发器 RE-52A(上海亚荣生化仪器厂);KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)等。

2 实验方法

2.1 大豆茎中黄酮类化合物的提取

2.1.1 原料的预处理

黄酮通常存在于植物细胞内,而细胞膜产生的扩散阻力使其浸提速率比较小。为了提高提取效率,需要对细胞进行预处理如干燥、粉碎等,这样有助于细胞膜的破裂,溶剂也容易浸入细胞内部直接溶解黄酮[4]。因此将大豆茎70℃烘干,粉碎,备用。

2.1.2 提取因素及其条件的确定

为全面考察超声提取法的工艺参数及最佳操作条件:确定以乙醇体积分数、超声时间、固液比、超声频率4因素且每因素3水平进行正交试验设计,通过测定大豆茎中的总黄酮提取率,确定最佳的提取条件。试验确定的因素水平见表1。

表1 试验因素水平表

2.1.3 芦丁标准曲线的绘制[5]

精密称取芦丁对照品25.0mg,置100mL量瓶中,加80%乙醇溶解并加至刻度。精密吸取2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0mL分置于 50mL量瓶中,分别加5%亚硝酸钠溶液 1.5mL,混匀,放置 6min,再加 10%硝酸铝溶液1.5mL,混匀 ,放置 6min,加 4%NaOH溶液 20mL,加水至刻度,摇匀,放置15min。在510nm的波长处测定吸光度。以吸光度 (A)为纵坐标 ,浓度 (C)为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线形回归,得芦丁溶液浓度(C)与吸光度值(A)关系曲线的回归方程式:y= 5.5402x+ 0.0028,R2=0.9996

2.1.4 提取物中黄酮类化合物含量的测定

分别量取一定体积的待测提取液,置于50mL量瓶中,分别加5%亚硝酸钠溶液1.5mL,混匀,放置 6min,再加10%硝酸铝溶液1.5mL,混匀,放置 6min,加 4%NaOH溶液20mL,加水至刻度,摇匀,放置15min,用紫外分光光度计,1cm比色皿在510nm的波长处测定提取物的吸光度。

2.2 大豆茎中黄酮类化合物的抗氧化作用

2.2.1 羟基自由基的清除

用 Fenton反应法[6]:取5支带塞的试管,依次编号,每支试管分别加入9mmol/L FeSO41mL,9mmol/L水杨酸-乙醇溶液2mL,按试管编号各加入不同浓度的黄酮提取溶液2mL,最后加入 8.8mmol/L H2O22mL进行反应,于37℃水浴反应40min,在525nm处测定样品的吸光度(AS),以蒸馏水代替黄酮溶液,同上述操作,测定吸光值(A0),以磷酸盐缓冲液为空白。清除自由基活力 SA可用公式表示:

清除率 SA=(A0-As)/A0× 100%

2.2.2 抗自氧化作用

采用烘箱储藏法测定提取物对猪油自氧化的抗氧化能力。猪油由市售板油在烧杯中用文火熬炼而成。称取粗黄酮粉 0.05g、0.10g、0.20g,各用5mL 60%乙醇溶解后分别加到20.00g温热猪油中,搅匀,以不加黄酮粉仅在20.00g猪油中加入 5mL60%乙醇为对照样,在65℃烘箱中强化保存,定时搅伴,每隔2d取样测定猪油中的过氧化值(POV值),并以此来表示猪油的氧化速度,进而评价大豆茎中黄酮类化合物的抗氧化活性。100%

式中:POV为样品的过氧化值,mmol/kg;V1为试样消耗硫代硫酸钠标准溶液体积,mL;V2为空白试验消耗硫代硫酸钠标准溶液体积,mL;N为硫代硫酸钠标准溶液的当量浓度,mol/L;0.1269为1mg硫代硫酸钠相当碘的克数;W为试样的质量,g。

3 结果

3.1 大豆茎中黄酮类化合物的最佳工艺

以表1所列因素进行 L9(34)正交实验,结果见表2。

表2 提取黄酮类化合物正交实验结果

由表2可见 ,乙醇浓度、超声时间、超声频率、固液比4个因素对黄酮提取量影响的主次顺序为:固液比＞乙醇浓度＞超声时间＞超声频率,大豆茎黄酮最佳的提取条件为固液体积比为 1：12,乙醇浓度60%,超声时间 45min,超声频率80Hz,即 A1B2C2D2,提取率为0.819%。

3.2 大豆茎中黄酮提取物对羟自由基的清除活性

根据 Fenton反应法,加入不同浓度黄酮提取溶液在525nm处测定的吸光度结果见表3。

表3 不同浓度黄酮的吸光度

图1 不同浓度黄酮提取物与清除率的变化关系

由图 1可以看出 ,大豆茎总黄酮提取液对由 Fenton体系产生的˙OH有一定的清除作用,随着总黄酮提取液浓度的增加,对˙OH自由基的清除能力也增强,当提取液浓度达到1.5%时,提取液对羟自由基的清除作用达最大。

3.3 POV值测定法

不同浓度的样品 POV值随时间变化情况如表4。

表4 超声法提得的黄酮化合物对猪油的抗氧化作用

由表3可以看出,大豆茎中提取的黄酮类化合物对猪油的自氧化有明显的抑制作用,随添加量的增加,抗氧化能力也随之增强。这主要是因为黄酮类化合物具有多酚结构,能够提供活泼的氢质子与油脂氧化产生的自由基结合成稳定的产物,从而阻断油脂的自氧化过程。

4 结论

大豆茎黄酮最佳的提取条件为固液比1：12,乙醇浓度60%,超声时间45min,超声频率80Hz;大豆茎中黄酮类化合物具有较强的清除自由基能力和显著的抗猪油过氧化作用,且在一定浓度范围内,大豆茎黄酮类化合物浓度越大,其抗氧化性越强。

[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴 [M].北京:科学出版社,1972,493

[2] 第二军医大学药学系生药学教研室.中国药用植物图鉴 [M].上海:上海教育出版社,1960,62

[3] 杜成,林丁杏.苞大豆茎化学成分研究 [J].中草药,2002,33(12):1071-1073

[4] 欧阳平,张高勇,康保安.类黄酮提取的基本原理、影响因素和传统方法 [J].中国食品添加剂,2003,(5):54-57

[5] 鲍士旦.土壤农化分析 [M].北京:中国农业出版社,2000,373-382,390

[6] 李贵荣.枸杞多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用 [J].中国现代应用药学杂志,2002,19(2):94-96