应用划痕标记染料示踪技术检测草苁蓉甲醇提取物对大鼠肝癌细胞功能的影响

颜 玉,鲍秀琦,薛 勇,姜 威,郑 强,任秀英,王艳凤

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学生命科学学院,黑龙江 佳木斯 154007)

划痕标记染料示踪实验(serape-loading dye transfer assav,SLDT)是观察和检测相邻活细胞之间 GJIC功能的重要指标和常规方法。通过划痕标记染料示踪实验,初步筛选出对大鼠肝癌细胞 GJIC功能有较强恢复和促进作用的草苁蓉甲醇提取物药物终浓度,进一步进行后续实验。划痕标记染料示踪实验是一种简单快速研究培养细胞间 GJIC的方法,适用于各种培养细胞 ,具有方法简单、实验周期短、成本低廉的特点。今后在研究药物影响细胞 GJIC功能的实验中,可以作为初步筛选待选药物的指标。为临床综合治疗肿瘤和拓展中药的新用途提供实验依据。

1 材料

1.1 大鼠肝癌细胞株

大鼠肝癌细胞株 CBRH7919购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.2 试剂与耗材

RPMI-1640细胞培养液为上海杰美基因医药科技有限公司产品;0.25%含 EDTA胰酶的消化液为上海杰美基因医药科技有限公司产品;胎牛血清为上海越研生物科技有限公司产品;新生牛血清为北京元亨圣马生物技术研究所产品;青、链霉素溶液为北京赛驰生物科技有限公司产品;二甲基亚砜(DMSO)为上海拜力生物技术有限公司产品;Lucifer Yellow CH和 Rhodamine B均为 Sigma公司产品;培养板、培养瓶、培养皿均为德国 Greiner bio-one公司产品;微孔滤膜为上海亚东核级树脂有限公司产品。

1.3 药物

1.3.1 草苁蓉甲醇提取物(BR)。

草苁蓉甲醇提取工艺流程:草苁蓉干品→ZN-08型中药粉碎机切碎→,加甲醇浸泡过夜→用布氏滤斗过滤,共提取4次,合并→ R2003旋转蒸发器减压浓缩→YC-015微型实验室喷雾干燥机→甲醇提取物(BR)。

1.3.2 RPM I-1640培养液的配制:按照 GIBCO产品说明书进行配制,调节 pH至 7.2～ 7.4,过滤除菌,分装 ,4℃保存。用时再加入10%新生牛血清和终浓度为100U/mL青、链霉素溶液。

1.3.3 罗氏黄染料的配制:称取 Lucifer Yellow CH和Rhodamine B各 5mg溶于 1mL PBS(0.01mol/L,pH7.4)中 ,作为罗氏黄染料的母液,-20℃保存。临用时再稀释到所需要的浓度[1]。

1.4 仪器

BNA-3210型 CO2培养箱 (日本 Espec);超净工作台 (苏州净化设备厂);3169型倒置显微镜 (重庆 COIC);荧光倒置显微镜及图像采集系统(Olympus);细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司);ALG 1104型电子天平(日本岛津);CDBER SCAN 510型 pH仪 (意大利 Hanna);Nex Power 1000型纯水器(韩国 Human Corp);YDS-30液氮器(四川省乐山市东亚机电工贸有限公司公司);XY J-801型电动离心机(江苏省金坛市医疗仪器厂 );JB-1型搅拌器(上海雷磁仪器厂新径分厂);BCD-215KANDZ电冰箱(青岛海尔股份有限公司);Haier冰柜 (青岛海尔特种电冰柜有限公司);YX280B手提式不锈钢蒸汽消毒器(上海三申医疗器械有限公司);电热恒温干燥箱(长沙医疗器械厂)。

2 方法

2.1 细胞消化、计数、铺板及培养

倒置显微镜观察,待传代培养的大鼠肝癌细胞生长融合率达90%以上时,吸尽细胞培养液,用 PBS(0.01mol/L,pH7.4)冲洗细胞 2～ 3次;滴加适量含0.25%EDTA的胰酶消化细胞,倒置显微镜观察,待细胞大部分变圆之时,吸去胰酶,加入适量 RPM I-1640培养液终止消化;用吸管轻轻吹打贴壁的细胞数次,倒置显微镜观察细胞大部分脱落悬浮后,将细胞悬液吸取至试管中,以1500r/min离心5min;弃上清,加入适量 RPMI-1640培养液,吹打混匀细胞;用细胞计数板计数细胞,把大鼠肝癌细胞按每孔 5×105个细胞接种到30mm的培养皿中,加入 RPMI-1640培养液至总体积 2mL,置于37℃,5%CO2培养箱内培养[2]。

2.2 细胞分组及药物处理

大鼠肝癌细胞培养24h后,将培养皿从培养箱内取出,吸弃每皿上清,每皿按总体积为2mL进行培养。大鼠肝癌细胞随机分为 5个组:分别为1个对照组、4个实验组。4个实验组加入草苁蓉甲醇提取物,使药物终浓度分别达到0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L;对照组加入与最高浓度药物等体积的 DMSO,加药后每皿体积不足2mL者,加入 RPMI-1640培养液总体积 2mL。置于 37℃,5%CO2培养箱内培养48h[3]。

2.3 测定指标和方法

大鼠肝癌细胞加药培养48h后,待培养皿中的大鼠肝癌细胞单层铺满培养皿底,按如下步骤操作:

(1)吸弃培养液后用预热 37℃的 PBS(0.01mol/L,pH7.4)轻轻冲洗 3遍,以除去细胞表面的杂质;

(2)用手术刀片在皿底轻轻划痕5道,然后加入0.1%罗氏黄染液 lmL,避光37℃孵育5min;

(3)吸净染液,用预热 37℃的 PBS(0.01mol/L,pH7.4)漂洗3遍并吸净,以除去游离的剩余荧光染料;

(4)每皿加预热37℃的 PBS(0.01mol/L,pH7.4)1mL,以防观察过程中细胞干涸、变形、死亡,于荧光倒置显微镜下观察并摄片。

荧光染料罗氏黄通过缝隙连接传递,在蓝色激发光下显绿色荧光,当细胞同时被染上绿色和红色时,说明这细胞是不是通过缝隙连接传递的,而是被荧光染料罗氏黄和罗丹明共同染色的凋亡或坏死的细胞,结果统计时应除外。通过观察 LY自伤沿列细胞向相邻细胞传递的距离进行半定量检测来评价细胞缝隙连接通讯功能的状态[4]。

结果判读:选择划痕较平滑处计数带有荧光的细胞层数,(-)荧光仅限于自伤沿单列(即荧光只出现在划痕旁 1列细胞中);(+)荧光自伤沿列细胞传递至邻近的一列细胞内(即荧光只出现在划痕旁 2列细胞中);(⧺ )荧光自伤沿列细胞传递至邻近的两列细胞内(即荧光只出现在划痕旁3列细胞中);(⧻)荧光自伤沿列细胞传递至邻近的三列细胞内 (即荧光只出现在划痕旁4列细胞中);()荧光自伤沿列细胞传递至邻近的四列细胞或更远距离。

3 结果

荧光染料划痕负载5min后,于倒置荧光显微镜下观察,结果显示(表1),空白对照组细胞的荧光染料主要出现在划痕旁1列细胞中,半定量为(±),荧光亮度低,细胞间染料传输功能差;与空白对照组细胞相比,细胞经草苁蓉甲醇提取物(BR)0.5g/L作用48h后的大鼠肝癌细胞中,荧光染料出现在划痕附近至划痕旁的2～ 3列细胞内,半定量为(),荧光亮度增加,细胞间染料传输功能增强;细胞经草苁蓉甲醇提取物(BR)0.75g/L、1.0g/L作用48h后的细胞中,荧光染料出现在划痕的附近细胞内至划痕以外的 5～ 6列甚至 7～ 8列细胞内,半定量为(),形成连片状的荧光染色,荧光亮度明显增加,细胞间染料传输功能显著增强;细胞经草苁蓉甲醇提取物 (BR)0.25g/作用48h后的细胞中,荧光染料出现在划痕附近至划痕旁的1～ 2列细胞内,半定量为 (+ ),荧光亮度稍增加,细胞间染料传输轻微增强。

表1 草苁蓉甲醇提取物(BR)对大鼠肝癌细胞 GJIC功能的影响

4 讨论

本实验采用草苁蓉甲醇提取物,使药物终浓度分别达到0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L对大鼠肝癌细胞生长有抑制作用的浓度对大鼠肝癌细胞 GJIC影响的研究。实验结果显示,空白对照组细胞的荧光染料主要出现在划痕旁1～2列细胞中而且亮度低,细胞间染料传输功能差,说明细胞之间的 GJIC功能丧失或降低;经草苁蓉甲醇提取物0.5g/L作用48h后的细胞中,荧光染料出现在划痕附近至划痕旁的1～ 3列细胞内,荧光亮度轻微增加,细胞间染料传输轻微增强。经草苁蓉甲醇提取物0.75g/L、1.0g/L作用48h后的细胞中,荧光染料不仅出现在划痕的附近细胞内,而且在划痕以外的5～ 6列甚至 7～ 8列细胞内也出现了明显的荧光。以上研究结果表明,在选取的草苁蓉甲醇提取物,使药物终浓度分别达到0.25g/L、0.5g/L、0.75g/L、1.0g/L分别作用于大鼠肝癌细胞48h后,与空白对照组相比,草苁蓉甲醇提取物0.5g/L更能显著增加细胞间染料传输功能。其机制可能为:大鼠肝癌细胞 GJIC状态差,细胞间正常的连接无法维持,荧光染料传递范围小,而草苁蓉甲醇提取物0.75g/L、1.0g/L作用于大鼠肝癌细胞后,在一定程度上恢复和促进了细胞的GJIC功能,重新建立细胞间连接,细胞间染料传输功能显著增加;而草苁蓉甲醇提取物0.25g/L对大鼠肝癌细胞 GJIC功能恢复和促进作用弱,因而细胞间染料传输功能弱。通过划痕标记染料示踪实验,初步筛选出草苁蓉甲醇提取物0.75g/L、1.0g/L对细胞 GJIC功能有较强恢复和促进作用,进一步进行后续实验。划痕标记染料示踪实验是一种简单快速研究培养细胞间 GJIC的方法,适用于各种培养细胞 ,具有方法简单、实验周期短、成本低廉的特点。今后在研究药物影响细胞 GJIC功能的实验中,可以作为初步筛选待选药物的指标。

[1] EL-Fouly M H,Trosko JE,Chang CC.Scrape-loading and dye transfer:a rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication[J].Exp Cell Res,1987,168:422-430

[2] Melet A,Song K,Bucur O,et al.Apoptotic pathways in tumor progression and therapy[J].Adv Exp Med Biol,2008,615:47-79

[3] 楚玉南,戴续红,吴华新.草苁蓉生物学特性初探 [J].中国林副特产,2009,3:104

[4] 高德宗.Fas系统与肿瘤治疗 [J].国外医学 (肿瘤学分册),2005,32(5):368-371