益生菌对大鼠溃疡性结肠炎作用的实验研究

薛 宇,颜 玉,蒲 田,张高扬,乔 坤,王美巍

(1.佳木斯大学临床医学院,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学第一附属医院消化一科,黑龙江 佳木斯 154003)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,其病因和发病机制仍不清楚,目前大多数研究认为细胞因子与 UC的发病有密切关系。细胞因子的表达,可作为检测 UC疾病严重程度的指标[1]。近年来的研究发现,核因子-kB(N F- kB)通过调控细胞因子的转录和释放而调节细胞因子的分泌,促进炎症反应,导致黏膜损伤发挥着重要作用[2]。转化生长因子-β(TNF-β)在多种组织细胞的增殖分化、间质形成、组织损伤修复、骨质再生、胚胎发生中起着关键作用[3]。同时研究证实 UC的发生与肠道菌群关系密切。近年来,有人尝试应用益生菌制剂作为治疗 UC的药物,其作用己经得到有效的肯定[4]。本研究采用益生菌制剂美常安治疗 UC大鼠,检测细胞因子 NF- kB和 TGF-β的变化,旨在从细胞水平上探讨益生菌对 UC的疗效,以期能够为应用益生菌制剂治疗 UC提供证据,从而为临床提供一个新的治疗 UC的方法。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备

选用佳木斯大学动物实验中心提供的健康 Wistar大鼠30只,雌雄各半,体重270～ 330g,将大鼠随机分为正常组,模型组 ,美沙拉嗪组,益生菌组,联合用药组 ,每组各6只。将30只大鼠禁食不禁水48h,用乙醚浅麻醉后放置于固定器中,正常对照组大鼠以2mL生理盐水经导管导入结肠,其余四组用5%乙酸1.0mL缓慢注入肛门内约8cm处,将大鼠倒置 10s后用4mL生理盐水冲洗。3d后,正常对照组和模型组每日给2mL生理盐水灌胃;SASP组以 0.5g/kg体重 SASP溶液2.5mL每日灌胃一次;益生菌组以12.5g/kg体重美常安溶液2.5mL每日灌胃一次;联合用药组上午8时以0.5g/kg体重 SASP溶液灌胃一次和下午4时以12.5g/kg体重美常安溶液每日灌胃一次,7d后处死,剖开腹部,取结肠组织,分别用蒸馏水和生理盐水冲洗,沿肠系膜剪开,取溃疡组织至于10%甲醛中固定。

1.2 病理学免疫组化学检测

将标本常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片厚度5 μm,粘于多聚赖氨酸处理后的切片上,染色步骤严格按说明书进行。阴性对照切片不加一抗,用0.1mmol/LPBS代替,不出现阳性反应,说明一抗特异性强。在40×10倍光镜下随机选择 6个视野,做免疫反应阳性细胞数计数,实验中使用兔抗鼠 NF-kB和 TGF-β均购自北京博奥森生物有限公司。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般状况

正常组大鼠活动如常,反应机警,毛发有光泽,饮食量正常,体重增加;模型组大鼠精神萎靡,毛发无光泽,饮食量减少,体重减轻,出现稀便、血便。各治疗组大鼠的一般状况随给药时间延长逐渐好转,饮食量增加,体重增加,血便消失,联合用药组一般状况改善明显。

2.2 结肠黏膜肉眼观察及病理切片检查

模型组结肠黏膜充血水肿,有多个大小不一的溃疡形成。益生菌组、SASP治疗组和联合治疗组肠壁仅见溃疡愈合后残留的痕迹。病理切片显示模型组有溃疡形成,肠黏膜上皮细胞坏死脱落,黏膜下淋巴细胞增生并有淋巴滤泡形成,中性粒细胞浸润,隐窝炎和隐窝脓肿;SASP和益生菌治疗组显示无溃疡,黏膜固有层内有少数淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞浸润、个别腺腔有灶性上皮坏死;联合用药组仅见黏膜上皮内灶性淋巴细胞浸润,其它无异常发现。

2.3 免疫组化技术检测细胞因子测定

见表1。

表1 各组大鼠 N F-к B及 TGF-β的变化 ±s,n=6)

表1 各组大鼠 N F-к B及 TGF-β的变化 ±s,n=6)

注:与正常组比较△P＜0.05;与模型组比较☆P＜0.05。

组别 N F-к B TGF-β正常组 9.39± 2.72220.4± 7.276模型组 44.16± 13.134△ 69.4± 19.329△美沙拉嗪组 19.22± 3.981△☆ 34.5±11.412△☆益生菌组 26.92± 8.309△☆ 38.5±12.436△☆联合治疗组 10.21±3.271☆ 25.4±8.079☆

从表1可以看出:①SASP组、益生菌组和联合用药组N F-к B、TGF-β表达均低于模型组,有显著性差异(P＜0.05),说明常规药物、益生菌及联合用药均可有效降低结肠粘膜 NF-к B、TGF-β表达。②联合用药组与益生菌组和 SASP组有显著差异 (P＜0.05),而与正常对照组无显著差异 (P＞ 0.05),说明联合用药治疗 UC比单独用药效果更佳。③益生菌组和 SASP组 N F-кB、TGF-β表达无显著差异 (P＞ 0.05),说明效果相当。

3 讨论

目前对溃疡性结肠炎的发病机制普遍认为主要由免疫反应介导,并与遗传、感染、环境因素等密切相关的慢性炎性疾病,其中细胞因子在 UC的发病中起着重要的作用。研究显示,N F-кB调控细胞因子的转录和释放,并且细胞因子分泌的增加有关,从而引起炎症反应。TGF-β有促进细胞外基质合成的作用,激活纤连蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ、V、Ⅵ等的合成与分泌;直接促进成纤维细胞合成细胞外基质,并对新合成的细胞外基质的降解有显著的抑制作用。本实验发现 UC大鼠 NF-кB及 TGF-β表达明显增加,与正常组相比差异有显著性,表明了 N F-к B与肠道炎症的产生有关,是一种调节各种炎症细胞因子、趋化因子的转录因子。在UC的研究过程中,近年来人们开始注意到肠腔内细菌在发病中的重要作用。UC病人的肠黏膜细菌的屏障功能是紊乱的。许多学者开始重视肠道共生菌群的变化,以求在细菌方面找到 UC的发病机制,并且设想用益生菌及其产物来治疗UC。本实验结果证实,应用益生菌美常安和 SASP后,可有效改善症状,减轻肠黏膜的病理损害,肠黏膜 NF-кB及TGF-β表达明显减少,但细胞因子表达与正常对照组尚有显著差异,而经联合用药治疗后,更显著改善大鼠腹泻症状,减轻肠黏膜病理损害,肠黏膜 N F-кB及 TGF-β表达明显减少,与对照组无显著差异,说明益生菌、SASP对治疗 UC确实有效,而联合用药效果更佳。益生菌的作用机制有以下几种可能:(1)益生菌作用后产生的低分子量多肽具有促进淋巴细胞增殖,而后者能恢复吞噬细胞的功能,从而杀灭和消除已侵入的微生物。(2)益生菌与肠黏膜免疫系统相互协作,维持对炎症的生理性控制和激活肠道相关性淋巴组织。(3)益生菌可以增强上皮紧密连接以阻止致病菌侵入。益生菌可以通过与致病菌竞争肠上皮微绒毛上的脂质和蛋白质上的相同复合糖(glycoconjugate)受体来达到阻止致病菌的定植。(4)益生菌通过促进损伤上皮的修复,防止致病菌在肠道上皮细胞间的移位。

[1] M Carlson,Y Raab,L Seveus,et al.Human neutrophil Lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis[J].Gut,2002,50:501-506

[2] Rogler G,Brand K,Vogl D,et al.Nuclear factor-κ B is activated in macrophages and epithelial cells of inflamed intestinalmucosa[J].Gastroenterology,1999,115:357-369

[3] 张云燕,石雪蓉.转化生长因子β的研究进展 [J].四川解剖学杂志,2006,14(3):30-32

[4] 余建新,韩春茂.益生菌的作用机制及临床应用前景 [J].中国微生态薛杂志,2002,14(6):371-374