肽合成*

张 宇,乌 恩,王国成

(1.内蒙古医学院药学院，呼和浩特 010110； 2.天津天士力研究院化学药物研究所，天津 300402)

上世纪90年代，多肽领域研究进入一个崭新的发展阶段。研究表明，生物体内含量极微的活性肽在生命过程中起着重要的调控作用[1-3]，这些活性肽与生物的发育、生长代谢、免疫、疾病、学习、记忆和衰老都有极其密切的关系。与传统药物相比，活性肽具有药用活性高、生物利用性好、副作用少等优点。因此活性肽的开发利用引起了各国科学家包括有机化学家、生物化学家、药物化学家、结构化学家等与生命科学有关的科学家的高度重视，近几年，其已发展成为国际市场上的一大类重要药物[4-6]。目前，得到活性肽的途径多种多样，本文主要就合成方面对肽进行简单阐述。

1 肽简介

两分子氨基酸经脱水以酰胺键联接生成的化合物称为肽。肽分子中的酰胺键称为肽键[7]。由两个氨基酸形成的肽叫二肽，三个氨基酸形成的肽叫三肽，肽分子中的每一个氨基酸部分称为氨基酸残基，开链状的肽的自由氨基一端称为肽链的氨基末端或N端，另一端则称为羧基末端或C端。通常把小于10个氨基酸残基的肽称为寡肽或小分子肽，10～80(或100)个氨基酸残基的肽称为多肽。

在温和反应条件下，肽键的形成是通过活化一个氨基酸(A)的羧基部分，第二个氨基酸(B)则亲核进攻活化羧基部分而形成二肽。如果羧基组分(A)的氨基未保护，肽键的形成则不可控制，可能形成线性肽或环肽等副产物，与目标化合物A-B混在一起。

所以，在肽合成过程中，对不参与肽键形成的所有官能团必须用暂时、可逆的方式予以保护，即每一个肽键的形成，包括三个步骤：第一步，对缩合反应中不参与反应的活性部分进行保护；第二步， N-保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体，随后于羧基保护的氨基酸进行缩合形成肽键；第三步，对保护基进行选择性脱除或全脱除。

2 氨基酸保护

2.1氨基保护及脱保护 用于氨基保护的保护基数目很多，按其结构可分为烷氧羰基、酰基、烷基三大类。烷氧羰基是目前应用最广的氨基保护基。表1列举了几种有代表性的烷氧羰基保护基及脱保护条件。

2.2羧基保护及脱保护 目前已知的大多数羧基保护基是由一级、二级，或三级醇制备的酯。表2列举了几种常见的羧基保护基。

表1 氨基保护基及脱保护条件

表2 代表性的羧基保护基

2.3侧链官能团保护 在氨基酸缩合反应中，由于不少氨基酸的侧链上都带有易参与反应的活性基团，如羟基、巯基、酚基、胍基、咪唑基、吲哚基等。为了避免副反应的发生，在多肽合成中往往也选用适当的保护基将其保护起来。表3列出了几个侧链官能团的常用保护基及脱保护条件。

表3 侧链保护基及脱除条件

2.4保护基的匹配 对于用在一个特定肽合成的各种不同类型的保护基，保护基的选择必须具备正交性，正交的意思就是每一类保护基的脱除各不相干。因此，为获得最佳正交性，各个化学裂解机制应该是不同的。

3 肽键的生成方法

3.1酰基叠氮物法 早在1902年，就有人将酰基叠氮物法引入到肽化学中，因此，该方法是最古老的缩合方法之一，在肽缩合反应过程中，叠氮物法对氨基酸很少发生消旋作用，因此，该方法一直被肽合成工作者广泛使用。最近我国学者李勤耕等[23]利用此种方法成功合成出一系列谷氨酰胺类抗肿瘤化合物。

叠氮法接肽分为三步，首先，羧基部分被甲酯、乙酯、苄酯等保护的肽在室温下进行肼解生成酰肼，然后酰肼在低温(-15 ℃以下)和酸性条件下与亚硝酸化物反应生成叠氮物，最后用有机碱调节pH 8～9，加入氨基组分完成接肽反应。机理如图1。

图1 叠氮法接肽反应机理

除此以外，人们还发现了一种磷酸酯型缩合试剂DPPA，其可以不经肼解，直接由羧基变成叠氮盐。与传统叠氮物法相比，由于其不需要酰肼中间体，简化了反应步骤，而且反应条件更加温和，因此受到人们的欢迎。机理如图2。

图2 DPPA接肽机理

3.2混合酸酐法 该方法是指先将保护的氨基酸的羧基制成高活性的混合酸酐，之后与氨基缩合生成肽的方法。混合酸酐法是上世纪50年代初期开始发展起来的，开始使用的制备混合酸酐的试剂主要是二苯基磷酸，然后是苯甲酸，现在应用最广的是氯甲酸烷基酯类，主要有氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁酯和氯甲酸异丙酯。混合酸酐法具有反应速度快、产物纯度高、产率高、经济性好等优点，因此备受当今药学工作者的厚爱。南京农业大学宓鹏程等人[24]于2007年成功利用此法合成出了胸腺五肽(TP5)中间体Fmoc-Tyr(t-Bu)-WangResin 。

反应过程中，羧基组分首先与氯甲酸异丁酯在低温下(-15 ℃左右)反应生成混合酸酐，然后在叔胺存在的碱性条件下与氨基组分反应生成肽。反应机理如图3所示。

图3 混合酸酐法接肽机理

3.3碳二亚胺法 在碳二亚胺法类方法发展过程中，二环己基碳二亚胺(DCC)首先用于肽合成，并且得到广泛应用，DCC相对便宜，而且可溶于肽合成常用试剂，但是用DCC作缩合剂会有二环己基脲(DCU)生成，DCU在水中和有机溶剂中均有一定的溶解度，致使在产物纯化过程中很难将其除尽。为此人们开发了水溶性的碳二亚胺EDC来代替DCC，反应完后只需要用酸或水洗涤即可除去反应生成的脲，有效的解决了这个问题。刘国都等[25]在合成活性三肽法氏囊素中也用到此方法。

碳二亚胺类的缩合试剂机理如图4，缩合试剂先与羧基组分生成活性中间体，然后再与胺基组分在碱性条件下完成肽链增长反应。

图4 碳二亚胺偶合反应机理

3.4酰卤法 该法类似于有机化学方法，用酰氯活化羧基，然后在室温或低温条件下形成酰胺，是一种常用的方法。然而，此种方法在试剂应用中只用于Fmoc-保护的氨基酸，原因在于Fmoc在酸性条件下非常稳定，而其他保护基保护的氨基酸很少用该法进行合成，因为多数学者认为酰氯法“过度活泼”且易发生消旋等多种副反应。

3.5苯并三唑型(BOP族) 以BOP为第一代苯并三唑型的缩合试剂可以说是缩合试剂里的一场革命，因为其接肽的效率要远远高于DCC，引起消旋的风险也明显减小。之后，人们又发现了同类型的缩合试剂HBTU、ByBOP、TBTU等。其共同点就是缩合试剂在有机碱的参与下先与羧基组分反应，生成羧酸的苯并三唑酯活性中间体，然后再与氨基组分反应生成目标多肽，如图5所示。

图5 BOP族缩合试剂接肽机理

4 结语

目前, 多肽类药物涉及激素、神经细胞生长和生殖等各生命领域并有直接影响细胞分化、神经质传递、肿瘤病变和免疫调节等多种重要功能[26]。据有关方面报道，2008年，全球多肽类药物总销售额已达750～800亿美元，每年还以20%的速度快速增长，肽类药物已经成为国际医药市场上的亮点。鉴于此,本文在查阅大量文献的基础上，对多肽常见的合成方法进行了归纳总结,希望以此推动肽类药物在治疗疾病中的应用。

1 Sun Guoying, Guan Chaxiang, Zhou Yong.Vasoactive intestinal peptide re-balances TREM-1/TREM-2 ratio in acute lung injury. Regulatory Peptides, 2011, 16(7):56

2 Ao Xiaoxiao, Fang Fang, Xu Feng.Vasoactive intestinal peptide protects alveolar epithelial cells against hyperoxia via promoting the activation of STAT3. Regulatory Peptides, 2011,168(1-3):1

3 Yoshitaka Umetsu, Takeshi Tenno. Structural difference of vasoactive intestinal peptide in two distinct membrane-mimicking environments. Biochimica et Biophysica Acta, 2011, 1814(5):724

4 李伟.多肽药物——医药市场的亮点．上海医药，2004，25(4)：119

5 余志红，鲁憬莉，向明.生物肽的临床应用及现状分析. 中国医院药学杂志，2009，29(23):2034

6 A. Mahmoudia, K. Nazari, M. Khosraneha.Can amino acids protect horseradish peroxidase against its suicide-peroxide substrate . Enzyme and Microbial Technology, 2008,43(4-5): 329

7 Yingwei Chiang, Wang Tzuhsien, Wenchien Lee. Chitosan coating for the protection of amino acids that were entrapped within hydrogenated fat.Food Hydrocolloids, 2009,23(3):1057

8 Ernesto M. Arbeloa , Mario O，Carignan ,etal. Mycosporine-like amino acid content in the sea anemones Aulactinia marplatensis, Oulactis muscosa and Anthothoe chilensis .Comparative Biochemistry and Physiology, 2010, 156 (3):216

9 Mario O, Carignan, Karina H M，etal.Palythine-threonine, a major novel mycosporine-like amino acid (MAA) isolated from the hermatypic coral Pocillopora capitata.Journal of Photochemistry and Photobiology, 2009,94(3): 191

10 Zhana Kravchuka, Begonya Vicedo, Victor Flors，etal.Priming for JA-dependent defenses using hexanoic acid is an effective mechanism to protect Arabidopsis against B. cinerea.Journal of Plant Physiology, 2011,168(4): 359

11 Linda K, Friedman, Menahem Segal. Early exposure of cultured hippocampal neurons to excitatory amino acids protects from later excitotoxicity.Int J Devl Neuroscience, 2010,28 (2) :195

12 R Rink, A ArkemaMeter, I Baudoin,etal. To protect peptide pharmaceuticals against peptidases.Journal of Pharmacological and Toxicological Methods,2010,61 (2): 210

13 Timm Trenktrog, Bernd W， Miiller. Preparation and characterization of a peptide containing w/o emulsion.International Journal of Pharmaceutics,1995,123 (1-2): 199

14 Xiangling Yin, Jill Wright, Trevor Wall,etal. Brain Endothelial Cells Synthesize Neurotoxic Thrombin in Alzheimer’s Disease.The American Journal of Pathology, 2010,176(3):211

15 Atsushi Maeda, Takayuki Mizuno, Masanori Bunya，etal. Characterization of Novel Cholesterol Esterase from Trichoderma sp.AS59 with High Ability to Synthesize Steryl Esters. Journal of bioscience and bioengineering, 2008,105(4)：341

16 Jin Jing, Huang Wenlong, Rao Guangling. Total Synthesis of MC2-a Peptide from Momordica Charantia and Its Hypoglycemic Activity.Chinese Journal of Natural Medicines，2011, 9(1): 58

17 H L Trivedi, A V Vanikar, U Thakker，etal. Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Combined With Hematopoietic Stem Cell Transplantation Synthesize Insulin.Transplantation Proceedings, 2008,40(3):1135

18 Eun Ju Oh, Kitae Park, JunSub Choi，etal. Synthesis, characterization, and preliminary assessment of anti-Flt1 peptide-hyaluronate conjugate for the treatment of corneal neovascularization.Biomaterials, 2009,30 (30) :6026

19 Tomas Radzvilavicius,Arunas Lagunavicius.Selective inactivation of M-MuLV RT RNase H activity by site-directed PEGylation: an improved ability to synthesize long cDNA molecules.New Biotechnology, 2011,3(2)：12

20 Jian Chen, Bei Zhang, Cao Xie，etal. Synthesis of a highly hydrophobic cyclic decapeptide by solid-phase synthesis of linear peptide and cyclization in solution .Chinese Chemical Letters ，2010，21 (4):391

21 Y Yoshihara M D, A Plaas, B Osborn B S k,etal. Superficial zone chondrocytes in normal and osteoarthritic human articular cartilages synthesize novel truncated forms of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chains which are attached to a chondroitin sulfate proteoglycan other than bikunin.Osteoarthritis and Cartilage,2008,16 (2) 16:1343

22 Jiapei Wang, Jianen Hu, Jinzhe Cui，etal.Purification and identification of a ACE inhibitory peptide from oyster proteins hydrolysate and the antihypertensive effect of hydrolysate in spontaneously hypertensive rats.Food Chemistry, 2008,111 (2):302

23 李勤耕，骆永鹏, 陈捷，等.叠氮法合成谷氨酰胺类化合物及其抗肿瘤活性.重庆大学学报，2002,25(5):159

24 宓鹏程，朱颐申，张琪，等.固相合成胸腺五肽(TP5).有机化学，2007,27(12):1525

25 刘国都，周乐.活性三肽法氏囊素的液相合成.西北农业大学，2008,17(1):46

26 陈贯虹，迟建国，邱维忠，等. 多肽药物的研究进展. 山东科学，2008,21(3)：42