反相高效液相色谱法同时检测肉汤培养基(CM129)中左氧氟沙星和阿奇霉素的药物浓度*

运乃茹，何志强

(1.天津中医药大学第二附属医院，天津 300150; 2.山西医科大学第二医院，太原 030001)

阿奇霉素是一种大环内酯类抗生素，前期实验中，发现阿奇霉素能够抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。氨溴索可以在铜绿假单胞菌形成的生物膜表面打孔，促进环丙沙星透过生物膜，为研究阿奇霉素对于成熟的生物膜是否存在类似氨溴索的作用，建立了一种检测CM129培养液中阿奇霉素与左氧氟沙星浓度的方法，用于检测左氧氟沙星与阿奇霉素合用的透过量。

1 仪器与试药品

1.1仪器 高效液相色谱仪：岛津LC-10A，LC-10AD紫外检测器，浙大N2000工作站，Waters反相C18柱(3.9 mm×150 mm)。pH计：上海雷磁PHSJ-4A型。分析天平：湘仪TG328B。磁力搅拌器：上海凯欣仪器厂85-2型。超声仪：上海BRANSON厂SB3200，隔膜真空泵：天津市南开区腾达过滤器件厂GM-0.15型。涡旋振荡器：BLENDER的ZH-2型。低速离心机：上海手术器械厂80-2型。

1.2试药 阿奇霉素和左氧氟沙星对照品(纯度>99%)购自中国药品和生物制品检定所，西司他丁钠对照品(纯度97.8%)由山西省药检所提供。甲醇、乙腈、异丙醇、二氯甲烷为色谱纯购自天津四友化学试剂厂。磷酸二氢钾及磷酸购自天津市化学试剂三厂，CM129培养基粉末购自Oxoid公司。

2 方法

2.1色谱条件 分析柱为Waters公司反相C18柱，流动相为甲醇-磷酸二氢钾缓冲液(29∶71，pH 2.53)，流速为1 ml/min，柱温为25 ℃，检测波长为210 nm，进样量为10 μl。左氧氟沙星保留时间为3.650 min，阿奇霉素保留时间为4.425 min，西司他丁钠做为内标，保留时间为6.874 min。在空白培养液中加入以上三种标准对照品，处理后进样，色谱图见图1。

1.左氧氟沙星 2.阿奇霉素 3.西司他丁钠

2.2样品的制备与处理 培养铜绿假单胞菌，使之附着于微孔滤膜(0.22 μm)上形成生物膜，分别于生物膜刚形成及形成后的5 d(银染观察生物膜是否形成)向此装置中加入左氧氟沙星与阿奇霉素，使之自由透过生物膜，透过生物膜后的培养液为待测样品，每种样本平行做3次。

取0.5 ml样品至离心管内，加入乙腈0.5 ml和异丙醇0.5 ml，涡旋振荡5 min，放入低速离心机以4 000 r/min速度离心10 min，弃沉淀，取上清液转移至另一离心管中，加入1 ml二氯甲烷，涡旋振荡5 min，放入低速离心机以4 000 r/min速度离心10 min，取出后静置1 min，分层，取上清液，转移至EP管中，取10 μl进样。试验参照文献[1-2]方法进行改进。

2.3标准曲线的制备 精密称取阿奇霉素及左氧氟沙星对照品各32 mg , 用蒸馏水分别定容于10 ml 的量瓶中, 分别使之成3.2 mg/ml的标准对照液，取西司他丁钠对照品10 mg，用蒸馏水定容至10 ml量瓶中，使之成为1 mg/ml的标准对照液。取五支试管，第一管加入1.2 ml CM 129培养液，加入0.4 ml的阿奇霉素标准对照液及0.4 ml左氧氟沙星标准对照液，其余四管分别加入1 ml的培养液。使用倍比稀释法稀释溶液，每管内加入50 μg/ml西司他丁钠1 ml。配制培养液中分别含左氧氟沙星、阿奇霉素浓度依次为160、80、40、20和10 μg/ml，西司他丁钠为25 μg/ml。阿奇霉素测得吸收峰响应值高度与西司他丁钠测得测得吸收峰响应值高度比值对阿奇霉素浓度进行线性回归，回归方程为：Y=0.048 2X-0.003(R2=1)；左氧氟沙星测得测得吸收峰响应值高度与西司他丁钠测得测得吸收峰响应值高度比值对左氧氟沙星浓度进行线性回归，回归方程为：Y=0.071 5X+0.013(R2=1)。

2.4回收率试验 空白CM129培养液加入阿奇霉素与左氧氟沙星对照溶液, 各加入西司他丁钠(1 mg/ml)做内标后，使之成20、40和160 μg/ml不同浓度,内标浓度25 μg/ml，按样品处理后进样,标准曲线上求得浓度与实际浓度相比得到回收率，重复3次，结果阿奇霉素和左氧氟沙星平均回收率分别为100.34%和99.83%，RSD分别为0.47%和1.08%。见表1。

表1 阿奇霉素和左氧氟沙星回收率测定结果

2.5精密度实验 在空白CM 129培养液中加入阿奇霉素、左氧氟沙星及西司他丁钠对照品配制高、中、低3种浓度的标准品CM 129培养液各5份, 按样品处理方法进行处理，进行测定, 计算方法的日内及日间精密度，阿奇霉素RSD为1.34%，左氧氟沙星RSD为0.94%，结果见表2。

2.6样品测定结果 样本1为生物膜刚形成加入阿奇霉素与左氧氟沙星，样本2为生物膜形成5 d后加入阿奇霉素与左氧氟沙星。取上述两种样本，依“2.1”项下色谱条件进样10 μl，分别检测培养液中两种药物的浓度。结果见表3。从方法学验证及检测结果的重复性来看，此类检测方法适合于此项实验中样本含量的测定。

表2 阿奇霉素和左氧氟沙星测量精密度试验结果

表3 样本结果测定值 μg/ml

3 讨论

此分析方法的建立可以用于检测透过生物膜的左氧氟沙星及阿奇霉素的浓度。对于铜绿假单胞菌生物膜的形成过程，目前已知氨溴索与乙酰半胱氨酸能促进左氧氟沙星(或环丙沙星)透过生物膜。从实验结果上来看，阿奇霉素在生物膜形成的初期，阿奇霉素与左氧氟沙星对于铜绿假单胞菌生物膜都有透过作用，但是当生物膜形成之后，阿奇霉素对左氧氟沙星透过生物膜没有影响，因此猜想阿奇霉素只有延缓生物膜形成的作用，对形成的生物膜并没有类似于氨溴索的作用，在另外的电镜实验中也证明了此观点。而对于左氧氟沙星自身能透过形成的生物膜，很可能左氧氟沙星本身在铜绿假单胞菌生物膜形成中，与PQS信号分子的结构相似，生物膜中存在PQS信号分子的自由通道，因此喹诺酮类药物自身对铜绿假单胞菌的生物膜就有透过作用。

1 潘强，张宁苏，易大为，等.复方阿奇霉素葡萄糖注射液中阿奇霉素的HPLC测定.中国医药工业杂志，2005，36(2)：99

2 刘皈阳, 张梅, 王睿,等.大环内酯类抗菌药物对加替沙星透过细菌生物被膜的影响.中华医院感染学杂志，2005,15(7)：725