结核分枝杆菌耐药相关药物外排抗原HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位预测*

陈 飞，高艳锋，朱宇皇，祁元明

郑州大学生物工程系郑州450001

全球约有1/3的人口是结核的潜伏感染者，每年世界上有180万人左右死于结核病［1］。耐药结核分枝杆菌数量的日益增加是造成近年来结核病死灰复燃、卷土重来的重要原因［2］。结核分枝杆菌耐药主要分天然耐药机制和获得性耐药机制。获得性耐药主要是由于耐药相关基因的点突变，而天然耐药主要由于细胞壁的通透性障碍和活跃外排泵系统［3］。因此，药物外排系统可以成为重要的耐药结核治疗靶点。近年来在动物模型及临床研究［4］中发现，CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)在抗结核感染保护性应答中起着重要和独特的作用。CD8+CTL对靶细胞发挥杀伤作用，必须能识别靶细胞表面与相应MHC-Ⅰ类分子结合的特异性抗原表位即CTL表位。目前研究的CD8+CTL表位主要集中在结核分枝杆菌特异的分泌蛋白上，如 ESAT-6、CFP-10、CFP-21、MPT64 及Ag85复合物等［5］，而对于膜蛋白尤其是药物外排蛋白CD8+CTL表位报道很少，因此该研究主要针对结核药物外排蛋白进行CTL表位预测。

1 材料与方法

1.1 资料来源 从NCBI网站获取耐药相关药物外排 抗 原 (Rv1634、Rv2846c、Rv2937、Rv2686c、Rv2687c及 Rv3065)的氨基酸全长序列:Rv1634(NP_216150.1)，471 个氨基酸;Rv2846c(NP_217362.1)，530 个氨基酸;Rv2937(NP_217453.1)，289个氨基酸;Rv2686c(NP_217202.1)，252个氨基酸;Rv2687c(NP_217203.1)，237个氨基酸;Rv3065(YP_177922.1)，107 个氨基酸。

1.2 分析方法

1.2.1 BLAST分析 利用 Internet网络进入 EXPASY 主页(http://www.expasy.ch/tools/blast/)，选database(Human)，选定Identity BLAST，输入各个蛋白的氨基酸序列后进行比对。

1.2.2 SYFPEITHI超基序法远程预测CTL表位

预测由9个氨基酸残基组成的CTL表位，具体方法:利用Internet网络进入SYFPEITHI主页(http://www.syfpeithi.de/)，选择 Epitope-prediction 进入CTL表位预测界面。对Rv1634/Rv2846c/Rv2937/Rv2686c/Rv2687c/Rv3065的HLA-A*0201限制性CTL表位进行远程预测，对分值较高的表位进一步进行分析。

1.2.3 BIMAS量化基序法预测分析 利用Internet网络进入 BIMAS 主页(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)，选定预测抗原肽长度(9)、CTL表位限制性MHC类型(HLA-A*0201)，将已获得的抗原氨基酸全长输入待预测序列框，运行远程预测程序，获得预测结果。

1.2.4 NetCTL预测分析 利用Internet网络进入NetCTL 主 页 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)，预测由9个氨基酸组成的CTL表位，选定supertype(A2)，阈值(0.75)，输入氨基酸序列后进行在线预测。

2 结果

6个结核分枝杆菌耐药相关药物外排抗原与人类蛋白进行BLAST分析的结果见表1。

表1 结核分枝杆菌耐药相关外排抗原与人类蛋白进行BLAST分析的结果

通过比较选择共筛选出21个HLA-A2限制性CTL 优势表位，分别为:Rv1634 54-62，170-178，184-192，248-256;Rv2846c 63-71，277-285，383-391，464-472;Rv2937 168-176，262-270，266-274，269-277;Rv2686c 74-82，151-159，181-189，184-192;Rv2687c 89-97，96-104，151-159;Rv3065 6-14，28-36(表2)。

表2 结核分枝杆菌外排抗原HLA-A2限制性CTL表位预测结果

3 讨论

Bay等［6］发现，结核分枝杆菌H37Rv株Rv1634基因编码一种假想的易化超家族(MFS)类外排泵Rv1634。当其在耻垢分枝杆菌过表达时，氟喹诺酮类药物敏感性降低，呈现出低水平耐药，提示这个外排泵与氟哌酸和环丙沙星外排有关。

EfpA(Rv2846c)是结核分枝杆菌H37Rv的外排泵蛋白，其二级结构与QacA转运家族(细菌及酵母中调节抗抗生素和化学药物抗性的蛋白家族)有很高相似性。从耻垢分枝杆菌基因组中克隆efpA基因，将之转染耻垢分枝杆菌MC2155后，敲除efpA对氟喹诺酮、溴乙锭及吖锭黄敏感性提高［7］。

drrA、drrB可编码ABC转运体，其具有泵功能的结构是DrrA2B2。Pradhan等［8］证明，drrB 表达需要与上游drrA翻译偶联，用替代基因替代drrA，发现drrB表达过度，因此，两者共同偶联才会在耐药机制中发挥作用。Rao等［9］研究发现，drrAB表达时耻垢分枝杆菌表现出对利福平、四环素、红霉素等一系列结构不同的临床常用抗生素耐药。

Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c这3个基因是共同表达的。研究这3个基因完整的操纵子及分别研究每一个基因的耐药情况及蛋白功能发现，过度表Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c的耻垢分枝杆菌MC2155，对环丙沙星高度耐药;而仅Rv2686c过度表达时，对环丙沙星中度耐药［10］。

Mmr在分枝杆菌的小耐多药性家族(SMR家族)中。将结核分枝杆菌的mmr基因转染至耻垢分枝杆菌MC2155，后者显示出对红霉素和溴乙锭等耐药，而对利福平和链霉素等则无变化［7］。敲除mmr表现对氟喹诺酮、溴乙啶及吖啶黄敏感性提高，该耐药表型由依赖能量的外排泵介导。微阵列分析发现mmr具有异烟肼、乙胺丁醇耐药性［11］。

随着生物信息学和互联网数据库的发展和积累，利用共享的专业表位预测数据库，综合分析结合力、结合半衰期、酶切位点等多项信息，成为当前表位预测主流方法。其基本理论依据为:某一特定类型的MHC-Ⅰ类分子可与多种不同的肽结合，但这些不同的抗原肽具有共同特点，即某些位置总是某一种或几种具有相似侧链或化学性质的氨基酸出现的频率比较高，对肽与某一特定MHC-Ⅰ类分子之间的结合起决定作用。针对某一MHC-Ⅰ类分子和固定长度肽，可得出各种氨基酸残基在各个位置的结合力评分，成为一个集合。目前已得到多种MHC-Ⅰ类分子的氨基酸结合力预测集合，构成了预测T细胞抗原表位的基础［12］。

NetCTL是近年来发展起来的整合预测程序，它综合了抗原肽提呈效率和酶切位点的打分，与目前公认的两大预测程序SYFPEITHI和BIMAS形成很好的互补［13］。SYFPEITHI和BIMAS都是基于抗原肽与MHC-Ⅰ类结合特性而建立起来的方法，未考虑针对抗原加工处理过程的预测，因此将两程序的预测结果再综合NetCTL进行分析，实现两类不同机制预测程序的有机结合，可以提高表位预测的准确率。联合使用多种基于不同运算法则的预测软件，可以减少传统预测方式的大工作量而且缩短时间。但是这也存在不足，表位预测方式并不能100%的将所有的优势表位都预测到，有些优势表位会被漏掉。

综上所述，尽管存在不足，这些表位仍有很大的可能是HLA-A2限制性CD8+CTL的优势表位，筛选表位后通过进一步的CTL表位鉴定可为以后基于CTL表位肽的免疫治疗及开发抗结核亚单位疫苗提供基础。

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