5-氟尿嘧啶对胰腺癌细胞sw1990增殖及相关基因表达的影响

朱春晖，谢 勇，吕农华#

1)南昌大学医学院研究生部南昌330006 2)南昌大学第一附属医院消化研究所南昌330006

抗代谢药物5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种在肿瘤治疗中经常使用的化疗药物，其本身是无活性的，在细胞内转化为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5-fluoro-2-deoxyuridine 5-monophosphate，5-FdUMP)等活性代谢产物［1］，在 RNA 和 DNA 代谢中发挥作用［2-4］。作者观察了5-FU对胰腺癌sw1990细胞增殖及相关基因表达的影响，探讨5-FU抗肿瘤作用的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料 胰腺癌sw1990细胞株由上海第二军医大学长海医院屠振兴教授惠赠。主要试剂:5-FU(上海旭东海普药业有限公司)、Trizol、M-MLV、dNTP、OligodT(15)、RNasin(Promega公司);无核酶水;Mastermix(Tiangen);石蜡油;无水乙醇;异丙醇;氯仿;总蛋白提取试剂盒(北京普利莱公司);各种抗体(Santa Cruz公司);荧光试剂盒(Pierce公司);DMEM(Gibco公司);胎牛血清 (杭州四季青公司);琼脂糖 (Amresco公司);其余试剂为国产分析纯。

1.2 实验分组 按6×3析因设计进行实验分组。因素1 为 5-FU 剂量，包括 0、50、100、200、400 和 800 mg/L共6个水平。因素2为作用时间，包括24、48和72 h 3个水平。使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中，按上述实验条件对sw1990细胞分组进行孵育培养，0.5 g/L胰酶消化贴壁生长的细胞进行传代［5］。

1.3 观测指标

1.3.1 细胞增殖抑制率检测 采用MTT法检测。胰酶消化后收集细胞，每组细胞以104个/孔接种于96孔培养板中。细胞覆盖率达70% ～80%后吸出培养基。每孔加入MTT溶液(5 g/L溶于PBS)20 μL，37℃孵育4 h。吸弃上清液，每孔加DMSO 150 μL振荡10 min，使蓝色结晶充分溶解，于酶联免疫检测仪上在490 nm波长处测定吸光度(A)，计算细胞增殖抑制率。抑制率=(对照孔A－实验孔A)/(对照孔A－空白孔A)×100%。

1.3.2 p53、bax及 pten mRNA 检测 采用 RT-PCR法。分别收集各组细胞，按 Trizol试剂盒说明提取总RNA，15 g/L琼脂糖凝胶电泳可见5S、18S、28S共3个条带，RNA样品经紫外分光光度仪测定，A(260 nm)/A(280 nm)比值在 1.8 ～2.0，适用于下一步实验，适用于下一步实验。RT-PCR按Promega试剂盒说明操作。引物序列及反应条件见表1。PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，用Bandscan图像分析软件进行吸光度积分值分析，以目的基因与内参照β-actin条带吸光度积分值之比作为目的基因mRNA的相对表达量。

表1 引物序列、反应条件及产物大小

1.3.3 P53、BAX、PTEN 及磷酸化 AKT(p-AKT)蛋白检测 采用Western blot法。分别收集各组细胞，蛋白提取及定量参照文献［5］。样品经凝胶电泳分离，电转移后膜封闭1 h，加入封闭液稀释的一抗(1∶200)，结合2 h，加封闭液稀释的二抗 (1∶1 000)，反应1.5 h。以β-actin为参照。ECL显色，X线胶片曝光，显影、定影，拍照保存，读取各条带A值，以目的蛋白与β-actin条带的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0进行数据处理5-FU作用时间和剂量对sw1990细胞增殖抑制率及凋亡相关基因mRNA表达的作用采用析因设计的方差分析进行评价，采用t或t’检验比较5-FU处理及未处理对sw1990细胞相关蛋白表达的影响，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 细胞增殖抑制率测定结果 见表2。可以看出，各剂量5-FU作用后sw1990细胞增殖抑制率随作用时间延长均有所增大。

表2 不同剂量5-FU作用不同时间后sw1990细胞增殖抑制率测定结果(n=6)%

2.2 p53、bax、pten mRNA 检测结果 见图1～3和表3～5。

图1 不同剂量5-FU作用24(左)、48(右)及72 h(右)后sw1990细胞p53 mRNA的表达

表3 不同剂量5-FU作用不同时间后sw1990细胞p53 mRNA的表达(n=6)

图2 不同剂量5-FU作用24(左)、48(中)及72 h(右)后sw1990细胞bax mRNA的表达

表4 不同剂量5-FU作用不同时间后sw1990细胞bax mRNA的表达(n=6)

图3 不同剂量5-FU作用24(左)、48(中)及72 h(右)后sw1990细胞pten mRNA的表达

表5 不同剂量5-FU作用不同时间后sw1990细胞pten mRNA的表达(n=6)

2.3P53、BAX、PTEN 及 p-AKT 蛋白检测结果MTT分析及RT-PCR检测结果显示，5-FU作用后sw1990细胞增殖明显受到抑制，但随着5-FU剂量的增高和作用时间的延长，虽然增殖抑制作用更加明显，但是凋亡相关基因的mRNA表达无明显增高，因此，综合考虑药物对细胞的毒性作用，选择50 mg/L 5-FU作用24 h为实验条件进行相关蛋白的检测。结果见图4和表6。

图4 50 mg/L 5-FU作用24 h后sw1990细胞P53、BAX、PTEN和p-AKT蛋白的表达

表6 P53、BAX、PTEN及p-AKT蛋白检测结果

3 讨论

抗代谢药物5-FU是一种在肿瘤治疗中经常使用的化疗药物，自从40年前Heidelberger首次合成以来一直是治疗实体肿瘤最有效的抗肿瘤药物。该研究结果显示，5-FU能显著抑制胰腺癌sw1990细胞的增殖，这种抑制作用具有剂量依赖性，并随作用时间的延长而有所增强。一般情况，细胞通过线粒体介导通路和膜死亡受体介导通路来调控凋亡。该研究结果表明，5-FU作用后sw1990细胞p53、bax、pten mRNA及相应蛋白表达上调。5-FU作用后通过诱导p53 ser42磷酸化，从而上调P53AIP1的表达，促进p53转录，增高P53蛋白水平［6］;同时，低浓度5-FU能诱导诸如rRNA生物合成断裂的核糖体应激，将核糖体蛋白从细胞核中解离出来，与MDM2结合，解除 MDM2对 p53的抑制，同时也能通过ATM和c-Abl激酶诱导MDM2的磷酸化，并抑制p53降解［7-8］。p53表达上调后可促 p21waf1/cip1、bax、puma等的表达，下调p-AKT蛋白的表达，触发了级联的下游事件，包括线粒体膜电位的崩溃，凋亡基因的线粒体蛋白细胞色素C(Cytc)和SMAC的释放，线粒体膜发生改变，Cytc及凋亡诱导因子(AIF)等释放入胞质，与胞质中的凋亡活化因子结合，继而活化 caspase-3、6、8 和9［9］及包括 FasL［10］和 fas相关的死亡结构域蛋白［11］在内的促凋亡基因，裂解大量底物(包括抗凋亡成分及结构蛋白等)。与此同时，5-FU诱导p53表达后能促进caspase-3和Bid的活化，并通过与Bcl-2蛋白家族有关的信号通路增加其诱导凋亡的能力［12］，最终通过线粒体介导通路和膜死亡受体介导通路发挥细胞增殖抑制及凋亡促进作用。

Klampfer等［13］研究表明致癌的 Ras信号能在体内促进5-FU作用后p53的积聚及其在丝氨酸15的磷酸化，从而促进凋亡而非生长停滞［13］。众所周知，胰腺癌细胞中Ras过表达，这是否在5-FU对胰腺癌细胞的p53诱导中发挥作用还有待进一步研究。

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