索坦对肾透明细胞癌786-0细胞生长与Tiam1表达的影响*

孟庆泽，乔保平，宫璀璀，刘德海，张喜卿

1)郑州大学第一附属医院泌尿外科郑州450052 2)中国人民解放军153中心医院泌尿外科郑州450042 3)中国人民解放军153中心医院中心实验室郑州450042 4)中国人民解放军153中心医院病理科郑州450042

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，转移是恶性肿瘤治疗失败和患者死亡的主要原因，尽管近年来各种治疗方法不断改进和完善，但转移性肾癌患者的预后仍然较差。因此，仍需进一步寻找和开发新的用于治疗肾癌的方法和分子靶点。Tiam1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1)是近年来发现的一种原癌基因，研究［1］发现Tiam1通过Tiam1-Ras信号通路调控肿瘤细胞的侵袭和转移，该通路的异常与多种恶性肿瘤密切相关。索坦能抑制多个受体酪氨酸激酶，降低血小板源生长因子受体、血管内皮细胞生长因子、干细胞因子受体等活性，进而抑制肿瘤生长，阻止病理性血管形成和肿瘤转移［2］。作者应用不同浓度的索坦干扰肾透明细胞癌株786-0，采用MTT和TUNEL法检测各组肾癌细胞凋亡和存活情况，采用免疫细胞化学和原位杂交技术检测各组肾癌细胞中Tiam1蛋白和mRNA表达情况，探讨索坦对肾透明细胞癌细胞Tiam1生长和表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和细胞 索坦购自美国辉瑞公司;Trizol试剂购自Invitrogen公司;DNAaseⅠ购自上海生工生物工程有限公司;5-溴4-氯3-吲哚磷酸/硝基蓝四唑盐(BCIP/NBT)购自Promega公司;鼠抗人Tiam1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;即用型免疫组化广谱试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。肾透明细胞癌细胞786-0为郑州大学医学院重点实验室保存。

1.2 细胞培养与分组 应用含体积分数10% 胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，置于36.5℃、体积分数5%CO2培养箱内，取生长状态良好的细胞用于实验。每孔2×107个细胞接种于96孔板中，每组设3个复孔，将处于对数生长期的786-0细胞分成4组:索坦低浓度处理(A)组、索坦中浓度处理(B)组、索坦高浓度处理(C)组、正常对照(D)组。细胞铺板后24 h，A、B和C组分别加入索坦2、4和8 μmol/L，D组加常规DMEM培养液，分别培养24、48、72 h。

1.3 Tiam1蛋白的检测 采用免疫细胞化学方法。40 g/L多聚甲醛固定的细胞标本经体积分数0.3%TritionX-100/PBS透化后，加正常羊血清封闭，Tiam1一抗按照1∶100稀释，4℃温度孵育过夜。PBS洗后，置37℃孵育1.5 h，DAB显色，伊红复染。阴性对照实验用PBS代替一抗。Tiam1蛋白阳性染色表现为黄色或棕色颗粒，以细胞质中表达为主。①染色强度:无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。②染色范围:随机选择5个高倍视野(×400)，阳性细胞百分比≤10%为0分，～25%为1分，～50%为2分，＞50%为3分。①×②为最后得分［3］。

1.4 Tiam1 mRNA的检测 采用原位杂交法。待细胞生长状态良好、铺满瓶壁后，用冰预冷的PBS洗2遍，参照说明书，用Trizol试剂常规提取细胞总RNA，总RNA用DNaseⅠ消化去除残存的基因组DNA。PBS液取代一抗作阴性对照。结果判定:Tiam1 mRNA原位杂交阳性信号呈蓝紫色，位于胞质内。光镜下每张随机选取10个高倍视野，按阳性细胞数所占百分比及着色深浅进行结果判定［4］。①按阳性细胞百分比计分:＜1%为0分，1% ～为1分，26% ～为2分，51% ～为3分，≥76%为4分。②按着色深浅计分:无着色为0分，淡蓝色为1分，蓝色为2分，蓝紫色为3分。①×②为最后得分。

1.5 细胞存活率的检测 各组细胞培养48 h后，MTT法测细胞存活率，每组3个复孔。每孔加20 μL MTT，继续培养4 h。弃去上清液，加DMSO 200 μL/孔，振荡，充分溶解。在酶标仪490 nm波长处读取吸光度(A)值。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.6 细胞凋亡率的检测 采用TUNEL法。取各组培养48 h细胞，用40 g/L多聚甲醛固定制备的滴片，5 μg/L蛋白酶K 37℃消化10 min。每片加末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)缓冲液18 μL，Bio-Dutp及TdT各1 μL，4℃过夜。加亲和素-碱性磷酸酶(SAALP)37 ℃，20 min孵育后，Tris-HCl pH 7.5洗3次，pH 9.5洗2次，BCIP/NBT底物显色，荧光复染。阴性对照用TdT缓冲液代替TdT。显微镜下观察，凋亡细胞核和(或)细胞质呈棕褐色，细胞核无着色为阴性。凋亡指数(apoptosis index，AI)的计算方法:每张计数200个细胞，重复3次，AI=(凋亡细胞数/200)×100%。

1.7 统计学处理 采用 SAS 9.1.3进行分析。同一时间点各组细胞和同组细胞不同时间点Tiam1蛋白和mRNA表达，以及各组细胞存活和AI的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 各组细胞Tiam1蛋白及mRNA的表达 见图1、2 和表1。

表1 各组细胞Tiam1蛋白及mRNA的表达(n=3)

2.2 各组细胞存活率及AI结果 见表2。

表2 各组细胞存活率和AI %

3 讨论

Tiam1是从小鼠T淋巴瘤细胞中分离鉴定出来的促肿瘤转移基因，位于第2l号染色体的 q22.1带，具有 DH、PH 等许多重要的功能域［5］。研究［6-8］发现，Tiam1在多种肿瘤组织及细胞中均有表达。Minard等［9］对11种乳癌细胞株的研究结果表明，Tiam1蛋白表达水平越高，细胞迁移和转移的能力越强。刘莉等［10］认为Tiam1与结直肠癌的转移显著相关。前期研究中作者发现肾透明细胞癌组织中Tiam1表达增强，且与肿瘤侵袭转移有关。作者应用不同浓度的索坦干扰肾透明细胞癌株786-0，结果显示:不同浓度的索坦处理24、48、72 h后，各组细胞Tiam1蛋白及mRNA的表达均较正常对照组下降，且随着索坦浓度增加，细胞Tiam1蛋白及mRNA的表达减弱;同一浓度处理组中，随着时间延长，Tiam1蛋白及mRNA的表达降低。另外，培养48 h随索坦浓度增加，细胞存活率降低，凋亡率增加。

综上所述，索坦可抑制肾癌细胞的生长，诱导细胞的凋亡，可抑制肾癌786-0细胞中Tiam1蛋白及mRNA的表达。由此作者认为Tiam1在肾癌侵袭、转移过程中可能起到重要的作用，索坦可通过抑制Tiam1蛋白表达来抑制癌细胞生长。

［1］Bouquier N，Vignal E，Charrasse S，et al.A cell active chemical GEF inhibitor selectively targets the Trio/RhoG/Rac1 signaling pathway［J］.Chem Biol，2009，16(6):657

［2］Motzer RJ，Michaelson MD，Redman BG，et al.Activity of SU11248，a multitargeted inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor and platelet-derived growth factor re-ceptor，in patients with metastatic renal cell carcinoma［J］.J Clin Oncol，2006，24(1):16

［3］钟天平，彭秋平，边志衡，等.结肠癌组织中Tiam1的表达与淋巴管生成之间的关系［J］.中华肿瘤防治杂志，2007，14(8):604

［4］Ding Y，Chen B，Wang S，et al.Overexpression of Tiam1 in hepatocellular carcinomas predicts poor prognosis of HCC patients［J］.Int J Cancer，2009，124(3):653

［5］Habets GG，Scholtes EH，Zuydgeest D，et al.Identification of an invasion-inducing gene，Tiam-l，that encodes a protein with homology to GDP-GTP exchangers for Rho-like proteins［J］.Cell，1994，77(4):537

［6］Liu L，Wang S，Zhang Q，et al.Identification of potential genes/proteins regulated by Tiam1 in colorectal cancer by microarray analysis and proteome analysis［J］.Cell Biol Int，2008，32(10):1215

［7］Stebel A，Brachetti C，Kunkel M，et al.Progression of breast tumors is accompanied by a decrease in expression of the Rho guanine exchange factor Tiam1［J］.Oncol Rep，2009，21(1):217

［8］Qi Y，Huang B，Yu L，et al.Prognostic value of Tiam1 and Rac1 overexpression in nasopharyngeal carcinoma［J］.ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec，2009，71(3):163

［9］Minard ME，Kim LS，Price JE，et al.The role of the guanine nucleotide exchange factor Tiam1 in cellular migration，invasion，adhesion and tumor progression［J］.Breast Cancer Res Treat，2004，84(1):21

［10］刘莉，许岸高，杨玉芳，等.Tiam1对结直肠癌细胞生物学特性的影响［J］.中华病理学杂志，2005，34(10):664