东方百合“索蚌”自交不亲合性的研究

栗艳龄，梁建萍，马跃龙，罗凤霞

（1.山西农业大学 信息学院，山西 太谷 030801;2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801;3.金陵科技学院 园艺学院，江苏 南京 210038)

东方百合“索蚌”自交不亲合性的研究

栗艳龄1，梁建萍2，马跃龙1，罗凤霞3

（1.山西农业大学 信息学院，山西 太谷 030801;2.山西农业大学 生命科学学院，山西 太谷 030801;3.金陵科技学院 园艺学院，江苏 南京 210038)

为研究百合自交不亲和发生的部位，以东方百合索蚌为试验材料，采用蕾期授粉、切割花柱授粉、延后授粉对东方百合索蚌自交后的花粉管生长和结实进行了研究。结果表明：索蚌自交不亲和性表现在花柱和子房中;蕾期授粉具有明显的花柱不亲和性;保留0.5cm花柱授粉能够克服花柱不亲和，花粉管可以进入子房，但坐果率为零，受精障碍存在于子房;延后6d柱头授粉能够克服索蚌的自交不亲和性，结实率可以达到26.7%，但每果有胚4.0个。

索蚌;不亲和;花粉管;结实

自交不亲和性也叫自交不育性，是指能产生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同体植物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时不能完成受精的现象，是花粉与雌蕊之间表现抑制作用所致，实质上是自花授粉时受精过程受阻。百合科的成熟花粉粒是由一个营养细胞和一个生殖细胞构成的二核花粉粒。根据孟金陵［1］所述，具二核花粉粒的物种表现为配子体不亲和性，所谓配子体不亲和性，是指花粉的不亲和反应是由花粉本身（配子体)的单倍体基因型决定的。在配子体不亲和反应中，共同细胞质中不存在特异物质，而特异物质是在各个小孢子内形成的。所以，这类植物的花粉可以萌发并进入花柱。但是，当花粉中的特异物质与花柱中的相应物质由于扩散而发生反应时，花粉管的生长就会停止，不亲和性表现在花柱内。针对百合不亲和性的特点，克服其方法大体上有切除柱头、切割花柱，应用化学调节剂，蕾期授粉和延迟授粉，离体授粉，混和花粉授粉，子房内授粉，染色体加倍，辐射花粉，热助授粉，注意正反交、改变杂交亲本染色体倍数、桥梁杂交等［2，3］。

索蚌“Sorbonne”是东方百合的一个品种，育种试验中发现其具有很高的自交不亲和性，得不到后代。本试验采用蕾期授粉、切割花柱授粉、延迟授粉三种常用克服不亲和性的试验方法，运用荧光显微法观测，结合留种试验，目的在于研究百合自交不亲和发生的部位及克服百合自交不亲和的有效方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

东方百合杂交种索蚌“Sorbonne”

1.2 试验方法

1.2.1 花蕾级别判定

设开花当天的花蕾为0级，开花前2d的花蕾为－2级，开花后2d的花蕾为＋2级，依次类推，直到－6级和＋6级（见表1)。

1.2.2 授粉方法

－6到－2级别的花在授粉前1d去雄，其余级别的花均在开花前1d去雄，对开花当天0级的花采用常规柱头授粉（对照)，仅切柱头授粉以及切掉1／2花柱授粉，保留0.5cm花柱授粉4种授粉方法，其余级别的花蕾均采用常规柱头授粉，每一级别或每种授粉方式均授50朵，授粉时间定在每天上午8：30～10：00。加强对留种母株的养护管理，两个月后采摘果实，测量其长和宽，计算蒴果的膨大系数，膨大系数＝果实膨大宽度／果实长;统计其坐果率和有胚种子率，坐果率（%)＝坐果数／授粉数×100，有胚种子率（%)＝有胚胚珠数／子房中胚珠数×100。

1.2.3 花粉管生长状态观察

授粉后4、24、48、96、144h，取下花柱和子房放入FAA固定液（甲醛∶冰乙酸∶70%酒精＝1∶1∶18体积比)中，每个处理5个，固定24h后，放入75%酒精保存备用。然后再将样品放于1 mol·L－1NaOH溶液中，60℃下进行软化至全透明状，再用蒸馏水清洗3次去除NaOH，放入0.1%水溶性苯胺蓝（0.1mol·L－1K3PO4)溶液中染色24h，用BH-2型Olympus荧光显微镜观测、记录、拍照。

2 结果与分析

2.1 不同级别花蕾授粉后花粉管生长行为观察

由表1和图1综合分析可知，授粉后4h，对照，＋2，＋4，＋6级花蕾授粉花粉粒均萌发，花粉管呈黄绿色（见图2中1)，生长情况几乎无差别，其余级别花蕾和切割花柱授粉花粉粒仍处于静止状态或少数透亮，此时，－2、－4、－6级花蕾和切割花柱授粉的花粉粒缺乏柱头分泌的粘液，导致花粉萌发慢，说明柱头分泌物中可能含有促进花粉萌发的物质。

图1 不同级别花蕾授粉后花粉管生长长度Fig.1 The length of pollen tube growth to different grades buds after pollination

表1 索蚌各级花蕾调查情况Table 1 The investigation of different buds in Sorbonne

授粉后24h，对于‘＋’级花蕾，随着级别的增加，花粉萌发的越多，花粉管伸长的越长，且花粉管突破柱头乳突组织向花柱道中延伸的数量也增加（见图2中2、3、4)，‘－’级花蕾，仅是零星萌发（见图2中5、6)。

授粉后48h，花蕾级别越高，花粉管延伸的越长，＋6级的花粉管已经超过了整个花柱的1／5，对照的花粉管刚接近花柱的1／6，－2级花粉管突破柱头乳突组织有向下延伸的迹象（见图2中7)，－4，－6级还停留在乳突，且花粉管数量仍未增加，未萌发花粉也没有要萌发的迹象（见图2中8)，切头和切1／2花柱的花粉管伸长的没有对照长，且后者要比前者花粉管数量少，说明上部花柱的存在可能对花粉管生长有一定促进作用，可以尝试采用上部花柱与子房嫁接授粉方法。保留0.5cm花柱的花粉管刚到达子房口（见图2中9)。

授粉后96h，对照中花粉管到达花柱的1／4，＋6级花粉管穿过花柱的1／3，＋2，＋4级花粉管长度处于对照和＋6级中间，－2级花粉管延伸还不到花柱的1／6，－4，－6级花粉管几乎没伸长，处于停滞状态（见图2中10、11)，切头后花粉管伸长的长度比切1／2花柱的长，保留0.5cm花柱的花粉管已进入子房与胚珠结合（见图2中12)，说明保留0.5cm花柱授粉能够克服下部花柱对花粉管生长的抑制作用。

授粉后144h，对于延后授粉，依然是随延后时间的增加，花粉管伸长的越长，且花粉管数量也逐级增加（见图2中13、14、15)，＋6级花粉管到达花柱的2／3，对照中花粉管还未达花柱的1／3，＋2，＋4级花粉管长度超过花柱的1／3，－2级花粉管也延伸到花柱的1／5，－4，－6级花粉管依然是零增长，切头的和切1／2花柱的花粉管长度达到整个花柱的1／4。

由此可见，花蕾级别越高，花器官发育得越成熟，花粉管生长得越好，说明成熟的花器官为花粉管的生长创造了良好的条件，根据杨晓苓［4］对雌蕊中保护酶和激素的研究及Iwanami Y［5］对花粉管生长的研究，推测柱头、花柱、子房中积累了大量促进花粉管生长的物质，在分泌细胞的引导下，花粉管向下生长。另外，在切割花柱授粉中，发现下部花柱对花粉管的抑制程度大于上部花柱，保留0.5 cm花柱授粉是相对有效的。

2.2 不同级别花蕾授粉对结实的影响

由表2可知，随着花蕾级别的增加，子房膨大个数和膨大系数也在增加，但花蕾只有在＋6级时授粉有效，且坐果率达26.7%，这说明延后6d授粉，花冠部分更趋于成熟，柱头、花柱、子房、胚珠更具备了受精能力，抑制花粉管生长的脱落酸等物质不会对花粉管造成影响，但有胚种子率相对较低，推测迟迟来到的精子与卵细胞生理结构不相匹配，不能完成正常受精，也许是受精后早期胚败育，需要适时进行早期子房切片、胚珠或幼胚离体培养;

图2 不同级别花蕾授粉后花粉管生长状况Fig.2 The condition of pollen tube growth to different grades buds after pollination

表2 索蚌各级花蕾授粉结实情况Table 2 The seeds of different grades＇buds after pollination in Sorbonne

＋2、＋4级授粉后膨大系数也相对较高，这与花粉管伸长的长度较长是相对应的，但坐果率为零，可能是由于花粉管伸长得越长，释放的雄激素信号传递到子房越快，对子房刺激作用越大造成的，也可能是由幼胚早期败育引起的;

切割花柱授粉中，切1／2花柱和保留0.5cm花柱授粉后的子房都呈膨大现象，且后者子房膨大系数接近延后6d授粉子房膨大系数，发现依然未坐果。先前观察到后者花粉管于授粉后96h已到达胚珠（见图2中12)，说明切割花柱授粉能够影响花粉管的生长，切得越长，花粉管进入子房的可能性越大，同时推测由于缺少花柱的缓冲作用，使得进入子房花粉管的数量减少，这样就减少了受精的机会，而得不到有胚种子;也可能是后期胚败育;也许是花粉管提前进入子房，雌雄配子生理上存在差异，可以尝试延后6d的切割花柱授粉，以上情况有待进一步研究。

－2、－4级花蕾授粉，子房轻微膨大，此时花冠部分并未成熟，尤其是先端柱头还未分泌粘液，不能使花粉更好地萌发，萌发的花粉也由于花柱的不成熟，花粉管不能健康生长，导致后期受精障碍;

0级花蕾授粉，子房膨大系数不及切割花柱（除切柱头)和延后授粉的子房膨大系数，此时花冠部分基本成熟，可能花柱中促进花粉管生长的物质还未产生或某些抑制花粉管生长的物质产生，导致花粉管畸形生长，后期发生受精障碍，因此，－2、－4级和0级授粉均无效，不能坐果结籽。－6级花蕾各花器过于幼嫩，授粉也无效。

3 结论与讨论

采用蕾期常规授粉不能克服索蚌自交不亲和性，存在着花柱障碍，授粉不成功。一方面缺乏了柱头分泌物，另一方面也许是花粉中的特异物质与未成熟花柱中的相应物质发生反应，阻碍花粉管生长。据Shivanna［6］研究，认为蕾期授粉是克服自交不亲和性最为成功的方法。可见，蕾期授粉方式在自交不亲和应用方面有一定的局限性。

采用保留0.5cm花柱授粉能够克服花柱不亲和，但不能克服子房不亲和。据齐国辉［7］研究报道，梨花柱中高水平的IAA、GA3和ZR有利于授粉受精正常进行，花柱中低水平的生长促进物质IAA、GA3和ZR使自交不亲和不结实。杨晓苓［4］也报道，自交亲和、杂交不亲和均能引起雌蕊中保护酶和激素的协同作用。切1／2花柱和保留0.5 cm花柱授粉效果优于切柱头授粉，子房膨大系数可观，但没有坐果，可能是花柱中缺乏IAA、GA3和ZR内源激素及酶活性的诱导，导致后期受精发生障碍，也许是雌雄生殖器官生理上的差异或早期胚败育，仍需进一步对受精过程中各项生理指标进行研究。

采用延后6d授粉有效，能够克服索蚌的自交不亲和性。前人［8～10］研究发现，花粉管尖端有大量钙离子通道分布，它们开放后会使花粉管前端形成一定的钙离子浓度梯度，该梯度控制着花粉管伸长生长的速度和方向。据张绍铃［11］研究报道，梨花柱中存在一种特异性的降解自花花粉管RNA的核糖核酸酶。据杨晓苓［4］等研究，不亲和授粉雌蕊中ABA始终高于自交授粉，高水平的ABA与杂交不亲和授粉有关。推测花器官发育越成熟，花粉管前端钙离子通道越开放，更容易控制花粉管伸长速度和方向;同时，降解自花花粉管RNA的核糖核酸酶和ABA含量的合成也减少，这样对花粉管生长和受精的阻碍作用就减小，致使子房膨大系数较高，但坐果率仅26.7%，种子有胚率只有1.51%，说明提高索蚌自交结实率还需在胚抢救方面进一步研究探讨。

可见，索蚌的不亲和性在花柱和子房中都存在，要想彻底搞清楚，除了采用多种克服自交不亲和性的方法之外，还需要从生理指标和分子水平上对受精过程中雌蕊产生的物质进行测定和研究，以期为百合杂交育种工作排除受精障碍提供一定的理论基础。

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Study on the Self-incompatibility inLiliumorentialSorbonne

LI Yan-ling1，LIANG Jian-ping2，MA Yue-long1，LUO Feng-xia3
（1.CollegeofInformation，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;2.CollegeofLifeSciences，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;3.CollegeofHorticulture，JinlingInstitute ofTechnology，NanjingJiangsu210038，China)

In order to study the position of self-incompatibility inLilium，withLiliumorentialSorbonne as material，pollen tube＇s growth and seed formation inLiliumorentialSorbonne inLiliumwere studied by bud pollination，cut-different-style pollination and delayed pollination.The results suggested that the self-incompatibility in Sorbonne manifested in style and ovary.The pollination on buds showed apparant style incompatibility.Retaining 0.5cm style pollination could bypass style incompatibility，the pollen tube could get into the ovary，but the fruit-setting rate was zero and the fertilization failure existed in ovary.The delayed 6dstigma pollination could overcome self-incompatibility in Sorbonne and the fruit-setting rate was 26.7%，but the number of embryos was four in every fruit.

Sorbonne;Self-incompatibility;Pollen tube;Seeds

S682.2

A

1671-8151（2011)06-0506-06

2011-06-20

2011-08-20

栗艳龄（1981-)，女（汉)，山西长治人，助教，硕士，主要从事花卉遗传育种方面的研究。

江苏省农业自主创新资金项目（CX（09)608)

（编辑：武英耀)