散发性肾母细胞瘤中DNMT1基因多态性和1p、16q染色体杂合性缺失的临床价值

白 锐，胡晓丽，李艳芸，赵林胜，耿 鑫，张维铭

(天津医科大学基础医学院，天津300070)

肾母细胞瘤(WT)是一种源于后肾胚胎组织、由间叶及上皮组织构成的恶性肿瘤，临床伴有多种器官发育畸形，占儿科肿瘤的87%［1］。DNMT1是DNA甲基化转移酶家族中的一个重要成员，其N端具有与DNA序列及多种蛋白如DMAP1、DNMT3a结合的特性，我们推测DNMT1蛋白在此区段的多态性可能会影响DNMT1与DMAP1、DNMT3a蛋白的结合。2010年8月～2011年10月，我们观察了35例WT患者肾组织DNMT1基因多态性，并探讨了DNMT1基因多态性及1p、16q染色体杂合缺失(LOH)与WT临床病理特征的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择天津市儿童医院病理科确诊的散发性WT患者肾组织35份(观察组)，男15例、女20例，年龄3个月～5岁;同期选择该院结核性、外伤性及尸检肾组织30份(对照组)，男17例、女13例，年龄5～14岁。所有标本未经放疗、化疗治疗，经石蜡包埋后，参照Biomiga GelDNA Extraction Kit说明提取组织DNA。

1.2 方法

1.2.1 单核苷酸多态性(SNP)位点分析 SNP位点的选取依据 dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)，在被研究区段内选取突变率较高的rs75616428、rs16999593位点，前者基因型为 C/G，后者为T/C。引物由primer3软件设计并由北京华大基因有限公司合成。相关参数见表1。

表1 引物序列长度及退火温度

1.2.2 PCR扩增及产物测序 用基因扩增仪对目的片段进行扩增，反应总体系为50 μl，其中2×Taq Master Mix 25 μl，高压灭菌超纯水 21 μl，100 mmol/L 上下游引物各 1 μl，基因组 DNA 模板 2 μg。SNP目的片段及内参的PCR扩增条件为:94℃预变性5 min，94℃，退火15 s，两SNP位点及内参的退火温度及目的片段长度见表1，72℃延伸10 min，重复34个循环后于4℃保温。同步实施的双向测序由北京华大基因有限公司完成。

1.2.3 酶切反应 rs75616428及 rs16999593两位点内切酶的选取依据NEBcutter2软件，操作分别依照BmrⅠ及BssSⅠ内切酶(Neb，美国)说明严格执行。酶切产物由3%琼脂糖凝胶电泳，其中rs75616428的G基因型的酶切产物长度为150、53 bp，rs16999593的C基因型的酶切产物长度为122、80 bp。

1.2.4 鼠抗DNMT1免疫组织化学 免疫组化采用二步法，微波热修复，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗做阴性对照，分别计算各组高表达样本所占的比例，评判标准依据参考文献［2］。

1.2.5 1p、16q LOH 分析 依据 Yuan 等［3］的研究，从位于WT内1p、16q LOH高频区域的大量微卫星灶中选取4个微卫星灶作为检测片段，即1p:D1S1469、D1S1676;16q:D16S3050、D16S303。行PCR扩增，目的片段及内参扩增在同一模板浓度及扩增条件下进行。以聚丙烯酰胺凝胶—银染法分析LOH结果，与对照组相比显色程度降低50%及以上者为未LOH。

1.3 统计学方法 采用SHEsis统计软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡、基因型频率、等位基因频率、连锁不平衡及单倍体分析;率的比较采用χ2检验;连锁不平衡检测采用D’值和R2值分析。

2 结果

2.1 SNP检测及易感性分析

2.1.1 PCR产物酶切电泳及测序 各位点PCR产物酶切后经3%琼脂糖凝胶电泳分离判断基因型，测序判断基因型见图1～3。

图1 DNMT1基因rs16999593位点测序图，箭头示C/C纯合子;图2 DNMT1基因rs16999593位点测序图，箭头示C/T杂合子;图3 DNMT1基因rs75616428位点测序图，箭头示C/G杂合子

2.1.2 基因型和等位基因分布比较 经SHEsis软件分析，WT组和对照组等位基因和基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，具有群体代表性。各位点等位基因和基因型分布见表2。

2.1.3 两位点的单倍型分析 应用SHEsis软件进行连锁不平衡分析，结果显示 rs16999593和rs75616428 一般连锁(D’=0.496，R2=0.003)，因此考虑构建这两个位点的单倍型进行分析。结果见表3。

表2 DNMT1基因rs16999593位点的基因型和等位基因的分布［例(%)］

表3 rs16999593和rs75616428单倍型分析［例(%)］

2.2 鼠抗DNMT1免疫组织化学 免疫组化显示除间质细胞外，DNMT1蛋白120 aa裸区段在上皮细胞、胚芽细胞及间变型WT中均有表达，与正常肾组织(36.70%)相比，WT组织中 DNMT1蛋白120 aa裸区段呈强阳性病例所占的比例(48.57%)略升高(P ＞0.05)。

2.3 1p、16q LOH结果分析 本实验所有样本在D16S303位点扩增产物均为120 bp。1p、16q LOH比例见表4。

表4 WT中1p、16q四检测位点在不同分期扩增量的对比

3 讨论

SNP是一种常见的等位基因突变，在人类基因组中平均每500～2 000个碱基对中就有可能存在一个多态性位点［4］。本实验中的 rs75616428、rs16999593位点均位于DNMT1的编码区，前者可导致H(His)-R(Arg)、后者可致 V(Val)-L(Leu)，由此翻译生成的DNMT1一级结构可因个别氨基酸通过改变其疏水性或与其他氨基酸形成新的化学键来影响DNMT1的构象。本研究中，观察组两SNP位点均出现了变异个体，尤其是rs16999593位点的变异率明显升高。连锁不平衡及单倍型分析表明，rs75616428、rs16999593位点存在连锁不平衡，但由于前者C-G变异型比率过低，不足以与rs16999593共同参与致病机制。

为进一步证明DNMT1蛋白这一多态性对此蛋白与相关蛋白如DMAP1和/或DNMT3a的影响，我们通过免疫组织化学技术检测了此未结合区段在瘤组织与正常组织中的表达，结果未发现两组间存在差异。DNMT1蛋白与DNMT3a形成复合物并参与细胞分化［5］，而与DMAP1蛋白形成的复合物可参与双链DNA损伤的修复［6］，因而与相关蛋白结合能力的减弱有可能影响胚胎期肾脏的发育及肾脏对自身损伤后的修复能力。基于DNMT1在此区段还具有结合DNA的特性，进一步的研究应致力于DNMT1多态性对DNMT1-DNA复合物形成的影响。

肿瘤伴染色体杂合性缺失在肿瘤生成过程中具有重要作用。大片缺失的染色体片段中包含大量细胞周期调节及细胞代谢调节基因如转移浸润抑制蛋白1p36、消耗性肾结核病蛋白4 1p36、钙黏蛋白16 16q22及SLC家族蛋白等，这些蛋白的表达缺失有可能影响肾脏发育及肾功能，且已有关于伴有1p/16q LOH的WT患者，其瘤组织对放化疗的敏感性明显降低［7］的报道。了解基因多态性及染色体LOH特性对制定个体化治疗方案有重要意义。

综上所述，我们认为DNMT1 rs16999593多态性可能是WT的发生危险因素之一，可作为对WT进行风险评估的一个参考指标，同时1p/16q LOH检测可作为诊断WT的简易方法。

［1］Martínez CH，Dave S，Izawa J.Wilms＇tumor［J］.Adv Exp Med Biol，2010，685:196-209.

［2］Meyer-Siegler KL，Iczkowski KA，Vera PL.Further evidence for increased macrophage migration inhibitory factor expression in prostate cancer［J］.BMC Cancer，2005，5:73.

［3］Yuan E，Li CM，Yamashiro DJ，et al.Genomic profiling maps loss of heterozygosity and defines the timing and stage dependence of epigenetic and genetic events in Wilms’tumors［J］.Mol Cancer Res，2005，3(9):493-502.

［4］Khatami F，Noorinayer B，Ghiasi S，et al.Lack of effects of single nucleotide polymorphisms of the DNA methyltransferase 1 gene on gastric cancer in Iranian patients:a case control study［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2009，10(6):1177-1182.

［5］Myant K，Stancheva I.LSH cooprates with DNA methyltransferases to repress transcription［J］.Mol Cell Biol，2008，28(1):215-226.

［6］Lee GE，Kim JH，Taylor M，et al.DNA methyltransferase 1-associated protein(DMAP1)is a co-repressor that stimulates DNA methylation globally and locally at sites of double strand bread repair［J］.J Biol Chen，2010，285(48):37630-37640.

［7］Charies AK，Brown KW，Berry PJ.Microdissecting the genetic events in nephrogenic rests and Wilms’tumor development［J］.Am J Pathol，1998，153(3):991-1000.