地塞米松诱导的危重病性肌病大鼠的TGF-β/Smad表达

袁 静，梁 佳，赵 颂，包翠芬*

(1辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001;2辽宁医学院科学实验中心)

危重病性肌病(CIM)是危重患者肌无力和肌麻痹引起的急性原发性肌病，以骨骼肌本身或神经—肌肉接头间传递障碍为特征，主要病理变化为肌肉萎缩和坏死［1，2］。目前，CIM 的发病机制尚未明了。研究发现，转化生长因子-β(TGF-β)/Smad通路在调节肌细胞(尤其是骨骼肌细胞)的生长、分化中起重要作用。为探讨TGF-β通路在CIM发生、发展过程中可能的调控机制，2009～2011年，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 动物、仪器及试剂 健康雌性SD大鼠40只，体质量180～210 g，由辽宁医学院实验动物中心提供。全自动免疫组化染色仪(美国DAKO公司);CIAS-1000型细胞图像分析仪(北京大恒公司);Carl Zeiss A1显微镜(德国公司);PowerPac 3000电泳仪、Trans-blot SD半干转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

地塞米松(SIGMA公司);兔抗大鼠TGF-β1、Smad3单克隆抗体(博奥森公司);细胞裂解液、蛋白质预染marker(Beyond公司)。

1．2 方法

1．2．1 CIM模型制备及鉴定 将大鼠随机分为正常对照组10只、观察组30只;观察组又分为7、9、11 d三个亚组各10只。观察组用地塞米松5 mg/kg腹腔注射，对照组用等量生理盐水腹腔注射，均每日1次。按照Lennon等提出的评定标准评定肌功能缺损程度。每天观察并记录各组肌功能缺损症状，不符合条件者剔除，并按严格的实验条件进行补充、分组。

1．2．2 组织标本制备 各组均用4%多聚甲醛经腹主动脉灌注固定，然后剖开左侧肢体，分别在垂直于比目鱼肌长轴方向处切取长约1 cm肌肉组织。继续用4%多聚甲醛固定约12 h，然后行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋，切片厚度5 μm。

1．2．3 免疫组化标本制备及检测 取上述切片行常规脱蜡至水，用3%过氧化氢液处理30 min，去除内源性过氧化物酶;采用高压修复抗原，按顺序滴加适当稀释的一抗、二抗及SP复合物;分别行DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片，在光镜下观察TGF-β1、Smad3阳性表达情况。阴性对照用PBS替代一抗。采用CIAS-1000型细胞图像分析系统，统计每个视野下TGF-β1、Smad3阳性表达的平均灰度。

1．3 统计学方法 采用SPSS10．0统计软件，数据用±s表示，多组间比较用单因素方差分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组肌功能缺损情况 对照组全部存活，无肌功能缺损症状;观察组死亡8只，其中观察7 d组出现肌肉功能缺损症状7只，观察9、11 d组均出现肌功能缺损症状，以观察11 d组肌功能缺损程度最重。

2．2 各组肌功能缺损评分及 TGF-β1、Smad3阳性表达 见表1。

表1 各组大鼠肌功能缺损评分及TGF-β1、Smad3阳性表达比较(¯x ± s)

3 讨论

TGF-β是具有多种生物活性的多肽类细胞因子，在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要的调节作用，与炎症、纤维化、肿瘤等密切相关。Smads作为TGF-β的下游信号分子，是将TGF-β信号从细胞外转导至细胞核内的关键因子［3］。TGF-β在细胞外与TβRⅢ形成复合物后被传递给经磷酸化的TβRⅡ或直接与其结合，形成二元复合物，进而激活TβRⅠ，形成三元/二元复合物，在靶细胞内与膜受体偶联的GS区形成信号复合物，活化Smad2/3的MH2结构域，进而与Smad4形成异源寡聚体复合物，随后转移到胞核发挥转录效应。

研究表明，TGF-β/Smad通路通过调控成肌调节因子影响肌卫星细胞增殖与分化，从而抑制骨骼肌特异基因表达［4］。近年研究显示，衰老可引起骨骼肌萎缩，TGF-β/Smad信号通路激活是导致肌卫星细胞丧失增殖修复能力的重要原因，抑制TGF-β/Smad信号通路可使衰老的骨骼肌恢复再生能力［5］。Hirose等［6］在尾部悬吊或去神经诱导的肌萎缩大鼠模型中发现，TGF-β及其信号转导受体TβRII/TβRI和介导子Smad均出现不同程度的高表达。目前，由地塞米松诱导的CIM大鼠的TGF-β/Smad通路如何发挥作用尚无报道。我们曾观察大鼠腹腔注射地塞米松5 mg/kg后的肌功能缺损情况，注射7 d时其出现肌功能缺损症状，光镜下可见不同程度的肌细胞萎缩;13 d时10只大鼠分别于12、13 d死亡。本研究显示，观察组死亡率为26．6%(8/30);观察7 d时 70．0%(7/10)出现肌功能缺损症状，9、11 d时均出现明显肌功能缺损症状，且其TGF-β1、Smad3阳性表达明显升高，以观察11 d时最明显。提示地塞米松诱导的 CIM大鼠随病程延长，其 TGF-β1、Smad3表达升高。

［1］Meherali SM，Parpio Y，Ali TS．Critical illness myopathy［J］．J Pak Med Assoc，2010，60(11):961-963．

［2］Müllges W，Stoll G．Critical illness polyneuropathy and myopathy［J］．Dtsch Med Wochenschr，2011，136(15):769-774．

［3］Burks TN，Cohn RD．Role of TGF-β signaling in inherited and acquired myopathies［J］．Skelet Muscle，2011，1(1):19．

［4］ Li X，McFarland DC，Velleman SG．Effect of Smad3-mediated transforming growth factor-beta1 signaling on satellite cell proliferation and differentiation in chickens［J］．Poult Sci，2008，87(9):1823-1833．

［5］Carlson ME，Conboy MJ，Hsu M，et al．Relative roles of TGF-beta1 and Wnt in the systemic regulation and aging of satellite cell responses［J］．Aging Cell，2009，8(6):676-689．

［6］Hirose T，Nakazato K，Song H，et al．TGF-beta1 and TNF-alpha are involved in the transcription of type I collagen al-pha2 gene in soleus muscle atrophied by mechanical unloading［J］．J Appl Physiol，2008，104(1):170-177．