骨髓间充质干细胞结合藻酸盐治疗椎间盘退变的实验研究

巢玉柳 金永 卞敏凯 张亮 蒋纯志

椎间盘退变是临床的常见病。本实验拟将兔骨髓间充质干细胞 （Bone Mesenchymal stem cells，BMSC）结合藻酸盐凝胶，治疗兔椎间盘退变，观察其可行性和治疗效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

新西兰大白兔 （南京医科大学动物中心），3月龄，1～1.8 Kg， 雌雄不限；DMEM 培养基 （Gibco公司）；胎牛血清（天津市北辰盛达生物制品厂）；藻酸盐（Sigma公司）；鼠抗人Ⅱ型胶原抗体以及 Elivision plus免疫组化试剂盒（迈新公司）；硫酸软骨素、木瓜蛋白酶（Sigma公司）；二甲基亚甲蓝（Aldrich公司）。

1.2 方法

1.2.1 移植物的制备

1.2.1.1 BMSC的培养和鉴定

实验兔以3%戊巴比妥（1 mL/Kg）耳缘静脉麻醉，股骨抽取骨髓约3 mL，FICOLL淋巴细胞分层液密度梯度离心，取中层单细胞悬液，加入DMEM培养液，贴壁法分离、培养BMSC。接种后5 d首次换液，以后每3天换液，约2周后细胞基本铺满单层后传代。倒置相差显微镜观察，贴壁的BMSC细胞呈长梭形，旋涡状排列，形成集落。

1.2.1.2 藻酸盐凝胶制备和体外BMSC复合体构建

将藻酸钠用三蒸水制成1.2%溶液，高温高压消毒备用。准备无菌100 mL氯化钙溶液。将已备好的BMSC悬液以1×106cells/mL浓度与藻酸钠混匀后缓慢滴入氯化钙溶液，可形成均匀的凝胶，吸取多余氯化钙溶液，加入DMEM培养液。2 d后换液，镜下观察三维支架内的细胞生长良好，切片，HE染色。

1.2.2 动物模型制备及实验分组

1.2.2.1 动物模型制备

取15只健康新西兰大白兔，麻醉，取腹部后外侧纵行切口，经腹膜外入路钝性分离腰肌到达椎体侧方，必要时破坏横突，暴露 L2/3、L3/4、L4/5、L5/6椎间隙，16号注射器针头刺入椎间隙5 mm，反复穿刺10次，并抽吸髓核组织。术后一天禁食，抗炎、补液。

1.2.2.2 实验分组

将制备的动物模型随机分为3组：治疗组、对照组和空白组，每组5只。在治疗组为方便复合体植入，藻酸盐凝胶在椎间盘内完成，将已备好的BMSC细胞悬液以1×106cells/mL细胞浓度与藻酸钠混匀后，微量注射器向损伤的椎间隙注射30 μL，然后从原针道注射氯化钙30 μL，在体内完成凝胶过程；对照组只注入没有细胞的藻酸盐凝胶；空白组在损伤椎间盘后注射生理盐水20 μL。

1.3 观察指标

1.3.1 腰椎MRI检查

术前 1 d、术后 2、4、8、12 周，连续行 MRI检查。静脉麻醉下进行MRI检查，采用自旋回波序列，TR：3 500 ms，TE 116 ms； 层厚 3 mm， 层间距 1 mm。Dabbs method的方法测量椎间隙高度，并测量髓核T2值，计算手术前后变化比值。

1.3.2 病理组织学及免疫组化

实验兔术后12周取材。原切口进入，迅速游离脊柱腰段。切开椎间隙，大体观察椎间盘组织，取材。10%福尔马林固定24 h，脱钙1周，沿正中矢状面纵行切开，制成蜡块，常规切片，厚 5 μm，HE 染色；按照Elivision plus免疫组化试剂盒说明书的方法进行免疫组化，检测组织中Ⅱ型胶原，一抗使用鼠抗人Ⅱ型胶原单抗。免疫组化结果以细胞外间质黄染为阳性，应用Leica Q550 IW计算机图像分析系统，定量评价呈阳性染色的细胞外间质的灰度值 （灰度分级0～255级，0级为最深，255级为最浅），测得结果为视野内棕黄色的平均灰度值 （每张切片随机采集4个高倍视野进行测定，200×）。

1.3.3 腰椎间盘髓核蛋白多糖的测定

200 μL/mL木瓜蛋白酶（含 50 mmol/L EDTA，5 mmol/L L-半胱氨酸）消化椎间盘组织24 h。取25 μL消化液与 125 μL二甲基亚甲蓝（3.04 g甘氨酸，2.37 g氯化钠，95 mL 0.1 M盐酸，16 mg二甲基亚甲蓝）混合，紫外分光光度计测量530 nm吸光值，用硫酸软骨素制作标准曲线。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 腰椎间盘MRI的变化

术后2周MRI检查显示3个组的椎间盘都出现退变表现，椎间隙狭窄，T2像上椎间盘信号减弱，（退变程度见表1，2）。 MRI检查测量手术前后椎间盘高度变化的比值，3组的椎间盘高度均有不同程度降低，其中治疗组变化最小。MRI检查测量手术前后椎间盘T2信号变化的比值，3组的椎间盘T2值均有不同程度降低，其中治疗组变化最小。3组的兔腰椎间盘手术前后5个时间点对比，发生不同程度退变，治疗组的退变程度明显轻于对照组和空白组。术后12周的3组椎间盘高度和T2值手术前后的变化比值经方差分析，P<0.05,差异有统计学意义。3组数据再行两两比较，治疗组与对照组、治疗组与空白组差异具有统计学意义（P<0.05），对照组与空白组差异没有统计学意义（P>0.05）。

2.2 大体观察与病理组织学结果

空白组和对照组术后12周椎间盘剖面大体观察示退变明显，椎体边缘骨赘形成，纤维环结构分界不清，髓核组织萎缩纤维化，出现裂隙；治疗组轻度退变，组织结构尚可分清，髓核组织结构饱满胶冻状。

HE染色示，空白组和对照组纤维环边缘破裂，髓核组织被纤维软骨样组织代替，而且皱缩出现空隙，髓核细胞数量减少。治疗组结构饱满，髓核细胞成团排列均匀。

2.3 蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量的变化

12周时空白组椎间盘髓核蛋白多糖的含量为(4.875±0.696)mg/100 mg，对照组(5.112±0.891)mg/100 mg，治疗组(6.135±0.771)mg/100 mg，空白组和对照组均明显低于治疗组（P<0.05）。治疗组与对照组、治疗组与空白组具有显著差异（P<0.05），对照组与空白组差异没有统计学意义（P>0.05）。

12周后，Ⅱ型胶原免疫组化染色示治疗组椎间盘组织阳性染色强于对照组与空白组。经图像分析仪半定量测定，空白组 （151.112±1.997），对照组（150.652±2.357），治疗组（142.14 ±1.754）；治疗组与对照组、治疗组与空白组具有显著差异（P<0.05），对照组与空白组差异没有统计学意义（P>0.05）。

表1 椎间盘术前与术后高度比值变化Table The ratio change of disc height Pre-and Post-operation

表2 椎间盘术前与术后T2值变化比较Table The ratio change of T2 value pre-and post-operation

图1 免疫组化检测各组椎间盘II型胶原（Elivision，200×）Fig.1 Collagen type II of intervertebral disc detected by immunohistochemical （Elivision，200×）

3 讨论

椎间盘退变是一个十分缓慢的过程。 Sahlman等[1]应用杂合敲除技术使小鼠表达Ⅱ型胶原的Col2a1基因失活，通过影像学、偏光显微镜和免疫组化等方法观察发现，椎体终板增厚钙化，蛋白多糖减少，继而发生椎间盘退变。这些变化表现在MRI上，可见椎间隙狭窄，代表含水量的T2信号强度减弱。本实验采取针刺法建立腰椎间盘退变的动物模型，术后2周MRI检查显示椎间盘均发生退变，椎间隙变得狭窄，T2信号减弱；术后12周大体及病理切片显示，退变椎间盘萎缩纤维化。实验组，移植BMSC结合藻酸盐支架，术后12周大体观察见组织结构饱满，Ⅱ型胶原、蛋白多糖含量多于其他2组，说明对退变椎间盘具有修复作用。

BMSC是具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能的细胞，可在体外分化培养扩增，传代稳定，可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。BMSC来源广泛，生物活性强。有研究认为，同种异基因的间充质干细胞对宿主的T细胞免疫反应有免疫抑制效应，可减轻免疫排斥[2]，使异基因间充质干细胞的临床应用存在可能。在本实验中，也未观察到因移植引起明显免疫反应和炎症反应。已有报道将BMSC作为种子细胞可在体外向髓核细胞分化[3－4]。

Sakai等[5]将兔自体间充质干细胞植入胶原凝胶支架，培养后再植入兔髓核中，结果显示胶原凝胶其可延缓椎间盘退变。

作为组织工程化椎间盘的支架要求具有良好的生物相容性（包括组织相容性和细胞相容性）、良好的生物降解性，并具备三维立体多孔结构和可塑性及一定的机械强度，要保证良好的材料-细胞界面。

藻酸盐是一种弹性无水D－甘露糖醛酸的聚合体，聚合体相对分子质量为5 000～15 000。在钙离子等二价离子存在时，通过离子交联作用聚合成开放晶格形式的三维结构的稳定的水凝胶。因其使用方便和良好的组织相容性，在组织工程骨和软骨的研究中被广泛应用。Horner等[6]从小牛尾部椎间盘分别取关节软骨、髓核、内外层纤维环，用35S标记后进行藻酸盐、胶原凝胶及单层培养，结果显示应用藻酸盐底物时细胞增殖最快，单层培养最慢。

本实验采取藻酸盐在椎间盘内局部注射，完成凝胶过程，操作方便，显示BMSC结合藻酸盐凝胶支架能增加髓核中蛋白多糖的合成，具有修复腰椎间盘退变的能力，有望成为治疗椎间盘退变的生物学方法。

[1]Sahlman J,Inkinen R,Hirvonen T,et al.Premature vertebral endplate ossification and mild disc degeneration in mice after inactivation of one allele belonging to the Col2a1 gene for Type II collagen[J].Spine,2001,26(23):2558-2565

[2]Krampera M,Glennie S,Dyson J,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigenspecific T cells to their cognate peptide[J].Blood,2003,101(9):3722-3729.

[3]Richardson SM,Walker RV,Parker S,et al.The Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation[J].Stem cells,2006,24(3):707-716.

[4]Richardson SM,Curran JM,Chen R,et al.The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells on poly-L-lactic acid(PLLA)scaffolds[J].Biomaterials,2006,27(22):4069-4078.

[5]SakaiD,MochidaJ,YamamotoY,etal.Transplantationofmesenchymal stem cells embedded in atelocollagen(R)gel to the intervertebral disc:a potential therapeutic model for disc degeneration[J].Biomaterials,2003,27(20):3531-3541.

[6]Horner HA,Roberts S,Bielby RC,et al.Cells form different regions of the intervertebral disc:effect of cultures system on matrix expression and cell phenotype[J].Spine,2002,27(10):1018-1028.