Pax-8基因敲除小鼠心脏中NR4A1基因表达上调

黄晓燕，高瞻，周希，梁万前，陈锡文，陈通克，杨德业（.温州医学院附属第一医院 心内科，温州医学院 心血管生物和基因研究所，浙江 温州35000；.温州医学院 实验动物中心，浙江 温州 35035）

先天性心脏病-室间隔缺损（ventricular septum defect，VSD）是常见的心血管疾病，但我们对其致病因素及发病机制却仍知之甚少。骨形态形成蛋白受体IA（bone morphogenetic protein receptor type 1A，又名ALK3）在心脏发育及室间隔形成中发挥重要作用[1-2]。已有心脏特异性ALK3基因敲除的小鼠模型培育成功[3]。ALK3基因敲除纯合子小鼠胚胎发育皆终止于中期，并伴室间隔缺损、心内膜垫和肌小梁发育不全[4]、心肌细胞凋亡增加[5]。在ALK3基因缺失造成心脏发育异常的具体通路的实验研究中，杨德业教授的团队发现转录因子paired box gene 8（Pax-8）在ALK3基因敲除的纯合子小鼠胚胎心脏中下调了7.1倍[6-8]。Pax-8参与心脏的正常发育，并与心肌细胞的凋亡有关[9]，Pax-8表达下调时细胞凋亡显著增加，细胞增殖活性下降[10]。

为了探讨Pax-8基因下调后引起细胞凋亡增多的机制，基因芯片和荧光实时定量PCR技术被应用于筛选Pax-8基因敲除小鼠差异表达的下游基因。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 Pax-8基因敲除小鼠模型由德国Peter Gruss和Ahmed Mansouri教授惠赠。Pax-8基因敲除小鼠纯合子（Pax-8 KO-/-）为实验组，Pax-8基因敲除小鼠杂合子（Pax-8 KO+/-）和野生型（Pax-8 KO+/+）为对照组。纯合子和杂合子小鼠由雌性Pax-8 KO+/-小鼠与雄性Pax-8 KO+/-小鼠交配所得。

1.2方法

1.2.1 Pax-8基因敲除小鼠的基因型鉴定：实验小鼠基因型由PCR法鉴定。引物为5’-GGATGTGGAA TGTGTGCGAGG-3’、5’-GCTAAGAGAAGGTGGATGAGAG-3’，和5’-GATGCTGCCAGTCTCGTAG-3’。PCR条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，经过10个循环后，再94 ℃变性15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，经过25个循环后，72 ℃延伸5 min。每组扩增产物取5μL，用含Gold View的1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统（quantity one）摄像分析。

1.2.2 芯片杂交：取Pax-8 KO-/-组与Pax-8 KO+/-组出生第1天（P0）小鼠各3只，心脏组织总RNA由TRIzol法常规提取，经紫外吸收测定和变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。按上海生物芯片有限公司试剂盒说明书操作，反转录标记cDNA探针并纯化。Cy3-dUTP标记Pax-8 KO-/-cDNA，Cy5-dUTP标记Pax-8 KO+/-cDNA，将含31802个小鼠基因的Mouse OneArrayTMWhole Genome DNA microarray芯片（购自台湾华联芯片）与探针杂交（按台湾华联芯片说明书操作）。结果采用Axon公司的Gene Pix4100扫描，Gene PixPro4.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。用管家基因进行Cy3和Cy5均衡。判断基因差异表达的标准为：①Cy3和Cy5信号比值>2.0为表达上调，<0.5为表达下调，0.5～2.0为不存在显著表达差异。②Cy3和Cy5信号比值其中之一必须>200或其中之一<800及Cy5/Cy3在0.1～10之间，作为判断基因差异表达的标准。

1.2.3 半定量RT-PCR：Pax-8 KO-/-组、Pax-8 KO+/-组和Pax-8 KO+/+组各取P0小鼠3只，心脏组织总RNA由TRIzol法提取。经紫外吸收测定和变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量后，取2μg总RNA进行逆转录反应（按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit RT试剂盒说明书操作）。每组各取0.3μg cDNA分别进行PCR扩增NR4A1和GAPDH片段。NR4A1上游引物为5’-ATGCGATTCTGCAGCTCTTCC-3’，下游引物为5’-GGGTGGTATTGTCGTAGTAGAAGG-3’，GAPDH上游引物为5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物为5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’（均由上海英骏生物技术有限公司合成）。管家基因GAPDH作为内参照标化NR4A1 mRNA表达。NR4A1反应条件如下：94 ℃预变性5 min后，94 ℃变性30 s，56.4℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。GAPDH反应条件如下: 94 ℃预变性5 min后，94 ℃变性30 s，54.6℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。分别当24、28、32、36个循环时中止反应，取5μL PCR产物用含Gold View的1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统（quantity one）摄像分析。

1.2.4 荧光实时定量RT-PCR：Pax-8 KO-/-组、Pax-8 KO+/-组和Pax-8 KO+/+组各取P0小鼠3只，如上述方法获得cDNA后，用NR4A1实时定量RT-PCR引物（由上海英骏生物技术有限公司合成）进行荧光定量PCR检测。NR4A1引物序列为上游：5’-TGTTG ATGTTCCCGCCTTTG-3’，下游：5’-ATGCGATTCTGCAGC TCTTCC-3’（由上海英骏生物技术有限公司合成），采用Beta-actin作为内部参照。用ABI 7500 FAST型荧光定量PCR仪检测，实验重复3次。通过比较ΔCt的方法进行NR4A1表达的定量分析，NR4A1的相对表达量用2－ΔCt表示。Ct为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，ΔCt为NR4A1 Ct值与内参Beta-actin Ct值之差。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 11.5.0统计软件进行处理，实验数据经过方差齐性检验，以±s表示，两组间均数比较采用t检验，检验水准α=0.01。

2 结果

2.1 PCR法鉴定Pax-8基因敲除小鼠基因型 Pax-8 KO-/-表现为约370 bp的单一条带，Pax-8 KO+/+表现为约390 bp的单一条带，Pax-8 KO+/-表现为390 bp和370 bp双条带（见图1）。

图1 PCR法鉴定Pax-8基因敲除小鼠的基因型

2.2 Pax-8基因敲除小鼠中差异表达的基因 通过基因芯片对31802个已知基因进行分析，发现与Pax-8 KO+/-组相比，在Pax-8 KO-/-组中25个基因表达下调，另外17个基因表达上调，其中涉及细胞周期、直接参与代谢、参与细胞信号转导及核转录因子的基因，部分差异表达的基因见表1。

表1 利用基因芯片获得Pax-8 KO-/-的部分差异表达基因

2.3 半定量RT-PCR法验证基因芯片筛查结果 针对基因芯片筛选出的上调和下调的基因的引物做PCR扩增，比较不同的扩增周期不同基因的PCR产物量。结果发现NR4A1的PCR产物在第28个PCR循环周期开始，Pax-8 KO-/-组明显多于Pax-8 KO+/-组和Pax-8 KO+/+组。说明NR4A1基因在Pax-8 KO-/-小鼠中表达上调（见图2）。

图2 在P0的Pax-8 KO-/-小鼠，Pax-8 KO+/-小鼠和Pax-8 KO+/+小鼠心脏中NR4A1和GAPDH基因在不同的PCR扩增周期的产量比较

图3 NR4A1基因定量RT-PCR结果

2.4 荧光定量RT-PCR结果 NR4A1在Pax-8 KO-/-组比Pax-8 KO+/-组和Pax-8 KO+/+组分别上调（1.53±0.08）倍和（4.80±0.35）倍（均P<0.01），而作为内部对照的Beta-actin基因水平在两组间差异无统计学意义（P>0.05）（见图3）。

3 讨论

NR4A1，又称为Nur77、TR3、NGFI-B等，是一种转录因子，属于核受体超家族一员，从氨基端到羧基端，一共有4个结构域组成（见图4）。由于目前没有发现NR4A1的配体，故他们又被称为孤儿核受体。

图4 NR4A1简图

无论在以细胞增殖为主的肿瘤细胞中[11-12]，还是在以细胞凋亡为主的生物过程中[13-14]，都可以找到NR4A1高表达的证据，表明其在增殖和凋亡上存在双重作用。目前研究表明，NR4A1在增殖和凋亡中的作用主要取决于细胞受到的分子信号：当细胞受到促进生长分裂的分子信号如Erk2等刺激时，NR4A1可作为转录因子，调节各种促进细胞增殖的基因表达[15]；当细胞受到促进细胞凋亡的分子信号如JNK[16]等刺激时，NR4A1通过磷酸化，与RXR（retinoid X receptor）形成二聚体，从细胞核内转移至线粒体，与Bcl-2蛋白结合。NR4A1能与Bcl-2的第三和第四个同源结构域-BH3、BH4之间的环结构结合，从而使BH3暴露，使Bcl-2从保护凋亡转为促进凋亡，触发细胞色素C释放，激活细胞凋亡[17]。

值得注意的是，在Pax-8基因敲除小鼠心脏中，同时存在较正常高表达的NR4A1与Bcl-2-like 14（Bcl2l14）基因[18]。而后者的激活形态只含有BH3一个结构域，能够显著促进凋亡。

在整个室间隔形成的过程中，包括在房室心内膜垫、间隔、流出道、肌小梁和乳头肌的发生中，细胞凋亡都扮演着关键角色[19-21]。在Pax-8基因敲除小鼠心脏中，可能存在由NR4A1介导的，通过Bcl2l14执行的细胞凋亡增加。使得在心脏室间隔发育过程中，细胞凋亡过度，室间隔形成缓慢甚至室间隔缺损——这是我们从本研究中得出的推测，然而需要确证这种假设还需要进行NR4A1细胞内定位，NR4A1干扰后观察Bcl2l14表达变化等实验。

致谢：此课题的完成得到德国Peter Gruss及Ahmed Mansouri教授的支持和帮助，尤其是惠赠实验动物，特此表示感谢！

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